基于MAP 的一种新型低毒仿生粘合材料*

成 昭，赵天赐，郑 蕾，冯凯茵，尉祎雯，程诗雅

（西安医学院 药学院，陕西 西安 710021）

引 言

海洋生物贻贝，通过足丝腺分泌主要成分为贻贝粘合蛋白（mussel adhesive protein，MAP）的特殊黏液，遇海水后立即固化，形成能够黏附于岩石、船舶等多种底材表面的黏附盘，表现出强大的生物粘合性能[1,2]。其中，位于MAP 侧链二羟基苯丙氨酸结构中的核心粘合单元邻二酚，具有在水环境中的离解与带电特性，能够与以Fe3+为代表的多种金属离子作用，从而实现MAP 在岩石、钢铁、玻璃等多种材料表面的粘合[3]。此外，粘合单元邻二酚具有较高化学活性[4,5]，还可通过一系列氧化反应实现聚合物链的链间交联[6,7]、完成反应型聚合粘合，进一步强化贻贝粘合蛋白的粘合性能（图1）。

图1 儿茶酚的可能粘合机制[8]Fig. 1 The possible adhesive mechanism of the catechol

在人工合成的粘合材料中，设计引入MAP 的邻二酚粘合单元，借助其生物亲合、防水粘合及快速固化性能，能够降低人工合成材料的细胞毒性及可能免疫应激反应，实现以仿生合成手段改善人工粘合材料的黏附与生物相容性能[9]，得到基于MAP仿生粘合基材的新型人工粘合材料。本论文以聚乙二醇、异佛尔酮二异氰酸酯、包含邻二酚单元的多巴胺盐酸盐为原料，通过高分子基体合成与粘合单元引入的仿生合成路径，得到一种MAP 型粘合材料，并进行合成路线设计，以调控材料结构、简化合成步骤，同时，考查材料的热稳定性、细胞毒性，初步评价该仿生粘合材料在生命体环境中的安全性和适用性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：傅里叶变换红外分光光度计（TENSOR T-27，KBr 压片，德国BRUKER）；超导核磁共振波谱仪（AVANCE Ⅲ，400MHz，溶剂DMSO-d6，内标TMS，德国BRUKER）；凝胶渗透色谱仪（PL-GPC50，美国Agilent Technologie）；热失重分析仪（PE-TGA7，美国Perkin Elmer）；多功能酶联免疫检测仪（1510 Mwltiskan Go，美国Thermo Fisher）。

试剂：DBTL（dibutyltin dilaurate，二丁基二月桂酸锡），购自国药集团化学试剂有限公司，分析纯；PEG 1500 （polyethylene glycol 1500，聚 乙 二 醇1500）、IPDI（isophorone diisocyanate，异佛尔酮二异氰酸酯）、DMPA（dihydroxypropionic acid，二羟甲基丙酸）、DCC（N,N'-dicyclohexylcarbodiimide，N,N'-二环己基碳二亚胺）、多巴胺盐酸盐、DMF、三乙胺、DMSO，均购自阿拉丁试剂有限公司，分析纯。

合成前的试剂预处理：PEG 1500、DMPA，于100℃下、减压干燥3h 后使用；DMF 使用前加入干燥剂无水硫酸钠、于室温下搅拌过夜，进行初步无水处理，滤除干燥剂后、于90℃减压蒸馏，弃去前后馏分、收集中间馏分，再加入4A 分子筛，密封、使用；三乙胺使用前加入干燥剂无水硫酸钠、于室温下干燥24 h，进行初步无水处理，滤除干燥剂后，常压蒸馏，再加入4A 分子筛，密封、使用。

1.2 合成

设计以扩链、偶联为主要合成路径得到了一种新型MAP 仿生粘合材料，其中，1）扩链步骤以PEG 1500、IPDI 为初始原料，通过PEG 1500 结构中多羟基单元与IPDI 结构中异氰酸酯基的连接得到聚氨酯预聚物（化合物1），经扩链剂DMPA、催化剂DBTL 作用，得到平均相对分子质量较小的聚氨酯预聚物扩链产物（化合物2）；2）在扩链产物结构基础上，通过功能修饰调控与碳二亚胺类缩合剂DCC作用，接入邻二酚粘合单元[10,11]，合成得到目标MAP高分子粘合材料（化合物3），实现MAP 的仿生合成（图2）。

图2 MAP 粘合材料的合成路径Fig. 2 The synthetic route of the MAP adhesive material

目标粘合材料（化合物3）基于MAP 结构中邻二酚粘合单元的粘合机制、进行仿生合成设计，能够初步保证粘合材料的低毒性及生物相容性；同时，以扩链与偶联为主要合成步骤、进行分段调控法合成，加强了粘合材料合成的可修饰性，能够使人工粘合材料未来研发工作中的分节点合成与功能化修饰进一步成为可能。

（1）聚氨酯预聚物（化合物1）的合成

将预处理之后的试剂IPDI 与PEG 1500，以物质的量之比2∶1.2 进行均匀混合，加入经除水处理的溶剂DMF 适量，氮气保护下反应6h，再经减压蒸馏得到聚氨酯预聚物（化合物1），为无色至浅黄色油状物。

（2）聚氨酯预聚物扩链产物（化合物2）的合成

将步骤（1）合成得到的聚氨酯预聚物（化合物1）、DMPA、DBTL，以物质的量之比1∶2∶0.2 进行均匀混合，氮气保护下反应3h，得到聚氨酯预聚物扩链产物（化合物2），为无色至浅黄色油状物。

（3）目标MAP 粘合材料（化合物3）的合成

将步骤（2）合成得到的聚氨酯预聚物扩链产物（化合物2）、DCC、多巴胺盐酸盐、三乙胺、DMF，以物质的量之比1∶0.12∶1∶0.1∶15 进行均匀混合，氮气保护下反应8h，得到粗产物沉淀。再以稀盐酸（2mol/L）进行粗产物沉淀的反复洗涤、透析，得到目标MAP 粘合材料（化合物3），为浅黄色油状物。

2 结果与讨论

2.1 表征

2.1.1 IR 与枝化率

将合成得到的该新型MAP 粘合材料进行KBr压片与IR 测定，得到如图3 所示的粘合材料红外吸收光谱。由图3 所标注的PEG 1500（合成中未加入催化剂DBTL）与PEG 1500+DBTL（合成中加入催化剂DBTL）两个系列吸收谱线的对比可知，通过调控催化剂DBTL 的加入与否，PEG 1500 与PEG 1500+DBTL 谱线中各官能团特征吸收峰的百分透过率呈现明显差异，从而能够对粘合材料侧链中粘合单元多巴胺的引入量做出初步判断，同时，能够对催化剂DBTL 影响聚氨酯预聚物进行扩链反应时的枝化率做出分析，以及进一步分析枝化率与MAP材料粘合性能的关系。在人工粘合材料的未来研发中，将可通过改变催化剂品类、性能，以及调控催化剂的加入量，从而实现对粘合材料的粘合性、枝化率等性能参数的进一步调控。

图3 MAP 粘合材料的红外吸收光谱Fig. 3 The IR spectra of MAP adhesive material

2.1.21H NMR

以DMSO-d6做溶剂、TMS 为内标，将合成得到的该新型MAP 粘合材料进行1H NMR 测定，得到其核磁共振氢谱（图4）。化学位移δ=7.82 处，呈现多巴胺酚羟基中活性H 与酰胺键中活性H 的特征位移，说明在MAP 粘合材料的侧链，通过聚氨酯预聚物扩链产物（化合物2）与多巴胺盐酸盐的扩链反应，成功接入了邻二酚黏性功能单元。

此外，由图4 所标注的PEG 1500-IPDI∶DMPA（1∶1）-DBTL（合成中加入催化剂DBTL）与PEG 1500-IPDI∶DMPA（1∶1）（合成中未加入催化剂DBTL）两个系列的谱线对比可知，保持测样量一致时，通过调控催化剂DBTL 的加入与否，PEG 1500-IPDI∶DMPA（1∶1）-DBTL 与PEG 1500-IPDI∶DMPA（1∶1）谱线强弱呈现明显差异，结合图3 的IR 分析，能够对粘合材料枝化率做出进一步的判断，即催化剂DBTL 能够显著提高MAP 粘合材料的枝化率，从而进一步影响其粘合性能。

2.1.3 GPC

以聚苯乙烯为标准聚合物、DMF（含0.01mol/L溴化锂）为流动相，保持流速1.0mL/min 与40℃的测定条件，进行GPC 测定，得到聚合物相对分子质量及其分布（图5，表1）。由表1 可知，多分散指数PD=Mw/Mn数值接近2、聚合材料分布均匀，黏均相对分子质量Mv=2662。

表1 MAP 粘合材料的相对分子质量及分布Table 1 The molecular weight and distribution of MAP adhesive material

图5 MAP 粘合材料的凝胶渗透色谱Fig. 5 The gel permeation chromatography of MAP adhesive material

2.2 MAP 粘合材料热稳定性分析

氮气条件下，保持升温速率为20℃/min，控制温度范围为40～600℃，取样5mg，进行该MAP 粘合材料的热失重分析（图6）。可见，该粘合材料具有平滑的热失重曲线，稳定性良好，呈现与弹性体热稳定趋势的相似性[12,13]。该粘合材料在250～350℃范围内主要存在两个热失重段，分别对应于聚氨酯材料的软段及硬段结构：软段热失重因IPDI 和DMPA 分解而产生，硬段热失重则是由于PEG 1500的分解所形成[12]。

2.3 MTT 评价MAP 粘合材料对ECV304 细胞增殖抑制作用

将对数生长期的EVC304 细胞接种于96 孔板，置于37℃、5%CO2及90%湿度条件下，培养24h，使细胞贴壁，更换新培养基，加入该MAP 粘合材料的DMF 溶液，保证终质量浓度分别为125、250、500、1000、2000、4000μg/L，每组浓度设6 个平行孔，对照组加入等体积溶剂。再将96 孔板置于37℃恒温培养箱中24h，去除培养基，每孔加入配置好的20μL MTT 溶液和180μL 培养液，培养4h。移去上清液，每孔加入150μL 二甲基亚砜，以60 次/min 的频率震荡10min，酶标仪测定490nm 处吸光度OD 值[14,15]，计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率= (1-OD 实验/ OD 对照) ×100%，绘制MAP 粘合材料对ECV304 细胞增殖抑制作用曲线，得到图7。

根据ISO10993-5.8，以细胞存活率降低30%以上作为判断生物材料存在细胞毒性的依据[16]。图7结果显示，所合成的MAP 粘合材料呈现低毒性，该材料在ECV304 细胞中的增殖抑制作用随浓度增加而增大，当其浓度达到最大测试浓度4000μg/L 时，对ECV304 细胞的增殖抑制作用仍低于30%。在体外活细胞环境中，该MAP 粘合材料就其浓度增幅整体而言，呈现较低毒性。

图7 MAP 粘合材料对ECV304 细胞的24h 增殖抑制作用Fig. 7 The anti-proliferative effect of MAP adhesive material on the ECV304 for 24h

3 结 论

基于MAP 生物粘合机制，设计仿生合成路径，经扩链、偶联得到聚氨酯侧链接入邻二酚粘合单元的一种新型MAP 人工合成粘合材料。以IR、1H NMR、GPC 等表征手段确认粘合材料的官能团信息与材料结构，通过热失重分析、MTT 实验评价该粘合材料的热稳定性与生物安全性。各项实验结果表明，合成得到的MAP 型粘合材料结构符合预期设计，质量分布均匀，黏均相对分子质量为2662，表现出良好的热稳定性与低毒性，对ECV304 细胞的24h 增殖抑制作用低于30%，具有进一步应用于生物医学领域、进行快速粘合修复的良好前景。

在未来研究工作中，为了进一步提升MAP 仿生合成材料的生物安全性、生物相容性及功能性，还可对合成路径中的聚氨酯中间体进行结构-性能调控，实现粘合材料的功能性修饰，复合以快速止血、促进愈合、药物缓释等功能，扩大MAP 复合粘合材料的适用性，满足生物医药领域对粘合敷料的快速闭合创口、免拆线与减少创口换药次数等实际需求。