IL-6抑制剂对种植体周围炎小鼠模型的疗效及其作用机制探讨

门贝 朱燕

[摘要]目的：探討IL-6抑制剂对种植体周围炎小鼠模型的疗效及其作用机制。方法：选取4周龄雄性小鼠（C57BL/6J）15只，实验总共分为三组（每组5只）：对照组（植入种植体，但未进行结扎诱导）、模型组（结扎诱导，构建种植体周围炎小鼠模型）和抑制剂组（结扎诱导+腹腔注射IL-6抑制剂）。使用微计算机断层扫描（Micro-CT）检测种植体周围骨丢失，苏木精和伊红（HE）染色检测种植体周围牙龈组织的炎症浸润，使用RT-qPCR检测牙龈组织中白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α） mRNA相对表达量，使用Western blot法检测牙龈组织中NF-κB通路相关蛋白p-P65和p-IκBα蛋白表达水平。结果：Micro-CT结果显示IL-6抑制剂可减少种植体周围炎的骨丧失。HE结果显示IL-6抑制剂处理后，小鼠炎症浸润显著减少。RT-qPCR和Western blot结果显示，IL-6抑制剂可显著降低牙龈组织中IL-6、TNF-α mRNA相对表达量以及p-P65和p-IκBα的蛋白表达水平。结论：IL-6抑制剂可抑制种植体周围炎的骨丧失和炎症浸润，这些治疗效果可能与抑制TNF-α的表达和NF-κB信号通路有关。

[关键词]IL-6抑制剂;种植体周围炎;小鼠模型;TNF-α;NF-κB通路;骨流失

[中图分类号]R782.12    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2022）05-0090-04

Curative Effect and Mechanism of IL-6 Inhibitor on Mice with Peri-implantitis

MEN Bei1，ZHU Yan2

（1.Department of Prosthodontics and Implant，Dazhong Stomatological Hospital，Wuhan 430000，Hubei，China;2.Department of Prosthodontics and Implant，Hubei Provincial People's Hospital，Wuhan 430060，Hubei，China）

Abstract： Objective  To investigate the curative effect and mechanism of IL-6 inhibitor on mice with peri-implantitis. Methods  Fifteen 4-week-old male mice （C57BL/6J） were selected， and the experiment was divided into 3 groups （5 mice in each group： the control group （implants implanted， but no ligation induction）， the model group （ligation induction： construction peri-implantitis mouse model） and the inhibitor group （ligation induction + intraperitoneal injection of IL-6 inhibitor）. Microcomputed tomography （Micro-CT） was used to detect peri-implant bone loss. Hematoxylin and eosin （HE） staining was used to detect inflammatory infiltration in peri-implant gingival tissue. The mRNA relative expression levels of interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in gingival tissue were detected by RT-qPCR. The protein expression levels of NF-κB pathway related proteins p-P65 and p-IκBα in gingival tissue were detected by Western blot. Results  Micro-CT results showed that IL-6 inhibitor could reduce bone loss in peri-implant inflammation. HE results showed that inflammatory infiltration in mice was significantly reduced after IL-6 inhibitor treatment. RT-qPCR and Western blot results showed that IL-6 inhibitor significantly decreased the mRNA relative expression levels of IL-6 and TNF-α， and the protein expression levels of p-P65 and p-IκBα in gingival tissue. Conclusion  IL-6 inhibitors can inhibit bone loss and inflammatory infiltration in peri-implantitis， and these therapeutic effects may be related to the inhibition of TNF-α expression and NF-κB signaling pathway.

Key words： IL-6 inhibitor; peri-implantitis; mice model; TNF-α; NF-κB pathway; bone loss

近年来，种植义齿由于其高度可预测性和高成功率被广泛应用于无牙牙合或牙列缺损患者的恢复[1]，然而据报道，仍然有30%的患者由于牙科植入物引起种植体周围炎（Peri-implantitis）[2]，种植体周围炎是种植体周围组织发生炎症，可导致骨丧失[3-5]，因此了解种植体周围炎的发病机制至关重要。研究发现IL-6在种植体周围炎中扮演着重要的作用，研究报道IL-6在种植体周围炎患者中高表达[6]，且抑制IL-6的表达可显著抑制种植体周围炎的发展[7]。然而IL-6在种植体周围炎中的作用机制还不完全明确，本研究将通过构建种植体周围炎小鼠模型，探讨IL-6抑制剂对种植体周围炎小鼠模型的疗效，并深入探究其作用机制，争取为临床上治疗种植体周围炎提供新的理论参考依据。

1  材料和方法

1.1 主要试剂和仪器：IL-6抑制剂（北京百奥莱博科技有限公司，货号为：M07110）;钛种植体（四川大学国家生物材料工程研究中心，中国成都）;甲醛（Thermo Fisher）;苏木精染色液（上海紫一试剂厂）;伊红染色液（上海古朵生物科技有限公司）;反转录试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）;RT-qPCR试剂盒[西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司];IL-6、TNF-α和β-actin引物（上海吉玛制药有限公司）;p-P65（Abcam）;p-IκBα（上海钰博生物科技有限公司）;β-actin（Abcam）;二抗（北京博尔西科技有限公司）;显微计算机断层扫描仪（Skyscan， Kontich， Belgium）;顯微镜（MV2100，苏州卡吉德化学科技有限公司）。

1.2 实验动物：4周龄雄性小鼠（C57BL/6J）15只，体重为18～22 g，购自华中科技大学动物实验中心，生产许可证号为：SCXK（鄂）2021—0009。实验前驯化1周。在实验期间，小鼠随机喂食软性饲料。

1.3 种植体周围炎的诱导：所有小鼠吸入3%的异氟醚进行麻醉，然后拔除左侧上颌第一、二、三臼齿，拔牙部位愈合8周后，将表面光滑的螺旋形状钛种植体植入上颌左第二磨牙区域，每只小鼠1颗，然后去除牙龈瓣并钻孔截骨，种植体植入牙槽骨深度约1 mm。种植体愈合4周后，在种植体根尖处和头部，分别用丝线扎入种植体，诱导种植体周围炎。正常对照组种植体未进行结扎。

1.4 给药和实验分组：15只小鼠，实验总共分为3组（每组5只）：对照组（植入种植体，但未进行结扎诱导）、模型组（结扎诱导）和抑制剂组（结扎诱导+腹腔注射IL-6抑制剂）。种植体周围炎小鼠模型构建成功后，腹腔注射5 mg/kg的IL-6抑制剂，每4周注射1次，总共注射3次，最后一次给药2 d后处死小鼠并检测相应指标，其中对照组和模型组给予相同剂量的生理盐水。

1.5 Micro-CT实验：将小鼠处死后，取各组小鼠上颌骨，切除皮肤以及肌肉后，在显微镜下收集腭侧牙龈组织，用4%的多聚甲醛进行固定，使种植体的头部和轴在矢状面和冠状面彼此垂直，然后在各向同性体素分辨率下进行检测。之后导入Dolphin软件，生成图像。然后采用三维形态分析并计算种植体周围骨丢失量[8]。

1.6 苏木精和伊红（HE）染色实验：取牙龈组织使用4%多聚甲醛进行固定，放入包埋盒中，用流水冲洗固定液，然后使用不同浓度的酒精进行脱水，用二甲苯进行透明，并将已透明的组织放入石蜡中进行包埋，之后对包埋好的组织进行切片（5 μm）。然后进行染色，将切片用苏木精水溶液进行染色，蒸馏水冲洗后使用酒精进行脱水，在用伊红染色液进行染色3 min，脱水封片后在显微镜下进行观察。

1.7 反转录酶-聚合酶链反应（RT-qPCR）实验：分离各组牙龈组织，加入裂解液进行匀浆，并使用试剂盒提取总RNA，检测提取的RNA浓度和质量后，使用反转录试剂盒把RNA反转录为cDNA，然后以β-actin作为内参进行反转录酶-聚合酶链反应。IL-6引物序列为：F：5’-GCTGGAGTCACAGAAGGAGTGGC-3’;R：5’-GGCATAAC GCACTAGGTTTGCCG-3’。TNF-α引物序列为：F：5’-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGG-3’;R：5’-TATCTCTCAGCTCCACGCCATT-3’。β-actin引物序列为：F：5’-GAGCGCGGCTACAGCTT-3’;R：5’-TCCTTAATGTCACGCACGCACGATTT-3’。

1.8 蛋白免疫印迹（Western blot）实验：收集各组小鼠牙龈组织，提取总蛋白，并使用BCA法测定蛋白浓度，将变性后的蛋白溶液进行上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，然后进行转膜，转膜后使用脱脂牛奶（5%）室温封闭1 h后，分别加入p-P65（1：500）、p-IκBα（1：400）和β-actin（1：5 000）一抗，然后4℃条件下培养过夜，加入二抗（辣根过氧化物酶标记）（1：5 000），室温条件下培养1 h后ECL进行显影，并进行分析和检测灰度值。

1.9 统计学分析：使用SPSS 26.0对所用数据进行分析处理，并用Graphpad prism 8.0作图，两组间比较使用t检验，多组间比较使用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2  结果

2.1 三组种植体周围骨质流失情况：各组种植体存活率均为100%，由图1A可知，与对照组相比，模型组的骨尖水平较高，而与模型组相比，抑制剂组的骨尖水平较低。由图1B可知，与对照组相比，模型组的种植体周围的骨质流失体积显著增多，差异有统计学意义（P<0.05）;而与模型组相比，抑制剂组的骨质流失体积显著减少，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 三组牙龈组织炎症浸润情况：由图2可知，对照组有轻度浸润，与对照组比较，模型组牙龈炎症严重浸润;而与模型组相比，抑制剂组牙龈浸润程度明显减轻。

2.3 三组牙龈组织中IL-6 mRNA表达：由图3可知，与对照组相比，模型组的IL-6 mRNA显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比，抑制剂组的IL-6 mRNA相对表达量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4 三组牙龈组织中TNF-αmRNA的表达：由图4可知，与对照组相比，模型组的TNF-αmRNA相对表达量显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比，抑制剂组的TNF-αmRNA相对表达量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。表明IL-6抑制剂可显著抑制种植体周围炎小鼠牙龈组织中TNF-α的表达。

2.5 三组牙龈组织中NF-κB通路相关蛋白表达：由图5可知，与对照组相比，模型组的p-P65和p-IκBα蛋白表达水平均显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）;而与模型组相比，抑制剂组的p-P65和p-IκBα蛋白表达水平均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。表明IL-6抑制剂可能通过抑制NF-κB通路抑制促炎因子的释放。

3  讨论

近年来，随着人们生活水平的提高，越来越多的人选择种植义齿来修复失牙，然而随着种植体在人群中应用的增加，种植体所引起的相关疾病也在逐渐增加，包括种植体周围黏膜炎和种植体周围炎[9]。据研究报道，有将近45%的种植体部位和近55%的种植体患者表现为种植体周围炎，种植体周围炎的主要表现为种植体周围组织损伤，具體为种植体周围牙槽骨破坏以及炎症反应[10-11]。种植体周围炎的发展是由多种因素造成的，其中白介素和肿瘤坏死因子等细胞因子在种植体周围炎的发生和发展中起着重要作用，白介素-6（IL-6）是一种炎症因子[12]，多个研究已经报道IL-6可促进种植体周围炎的进展[6，13]。IL-6抑制剂的使用已被证实在多种疾病中具有显著抗炎作用[14-15]。余科等研究发现IL-6抑制剂可显著减轻兔体内种植体炎症性骨吸收，并增加周围骨体积率[16]。然而IL-6抑制剂在种植体周围炎中的作用机制还不清楚，本研究通过构建种植体周围炎小鼠模型发现IL-6抑制剂可显著抑制种植体周围炎导致的周围组织骨流失并抑制牙龈组织中IL-6的表达，且HE染色结果发现，IL-6抑制剂处理后可显著抑制种植体周围组织的炎性浸润，这与余科等的研究结果一致。

肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种细胞因子，主要由活化的单核-巨噬细胞分泌，参与调控机体的炎症反应。近年来，有学者认为TNF-α在种植体周围炎中也具有重要的作用[17]。本研究发现IL-6抑制剂处理种植体周围炎模型小鼠后，可显著抑制牙龈组织中TNF-αmRNA的表达，这表明IL-6抑制剂可通过抑制种植体周围组织骨流失以及抑制TNF-α的表达减轻种植体周围炎。

NF-κB通路是一种经典的炎症反应相关的重要信号通路，在NF-κB通路被激活时，P65和IκBα发生磷酸化，NF-κB信号通路参与调控各个阶段的炎症反应，并被证实可调控包括TNF-α在内的许多炎症细胞因子。前人已经证实NF-κB通路在牙周炎的发生和发展中起着重要的调控作用[18-19]。本研究中发现，IL-6抑制剂可显著抑制种植体周围炎小鼠牙龈组织中p-P65和p-IκBα蛋白表达水平，这表明，IL-6抑制剂可抑制NF-κB信号通路P65和IκBα蛋白的磷酸化水平。

综上，IL-6抑制剂可通过抑制牙龈组织骨流失以及抑制促炎因子TNF-α的释放减轻小鼠种植体周围炎，其机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。

[参考文献]

[1]Simonis P，Dufour T，Tenenbaum H.Long-term implant survival and success： a 10-16-year follow-up of non-submerged dental

implants[J].Clin Oral Implants Res，2010，21（7）：772-777.

[2]Schminke B，Orde F V，Gruber R，et al.The pathology of bone tissue during peri-implantitis[J].J Dent Res，2015，94（2）：354-361.

[3]Mombelli A，Lang N.The diagnosis and treatment of peri-implantitis[J].Periodontol 2000，1998，17：63-76.

[4]Dhir S.Biofilm and dental implant： the microbial link[J].J Indian Soc Periodontol，2013，17（1）：5-11.

[5]John G，Becker J，Schwarz F.Modified implant surface with slower and less initial biofilm formation[J].Clin Implant Dent Relat Res，2015，17（3）：461-468.

[6]丁修明.炎症细胞因子IL-6、TNF-α和MMP-8在口腔种植体周围炎患者中的变化[J].基因组学与应用生物学，2019，38（11）：5335-5339.

[7]周峰，祝岩.补肾扶脾汤治疗口腔种植体周围炎疗效及对患者龈沟液IL-1β、IL-6的影响[J].陕西中医，2018，39（8）：1101-1104.

[8]Yu X，Hu Y，Freire M，et al.Role of toll-like receptor 2 in inflammation and alveolar bone loss in experimental peri-implantitis versus periodontitis[J].J Periodontal Res，2018，53（1）：98-106.

[9]杨成雪，喻正文，范芹.种植体周围病的病因及危险因素[J].临床口腔医学杂志，2020，36（5）：313-316.

[10]Ata-Ali J，Flichy-Fernández A J，Alegre-Domingo T，et al.Clinical， microbiological， and immunological aspects of healthy versus peri-implantitis tissue in full arch reconstruction patients： a prospective cross-sectional study[J].BMC Oral Health，2015，15：43.

[11]Liu S，Limiana-Caal J，Yu J.Does chlorhexidine improve outcomes in non-surgical management of peri-implant mucositis or peri-implantitis？： a systematic review and meta-analysis[J].Med Oral Patol Oral Cir Bucal，2020，25（5）：e608-e615.

[12]余渊，程杰.玉米须总皂苷通过调节炎性反应因子TNF-α和IL-6改善2型糖尿病大鼠脂代谢[J].世界中医药，2018，13（2）：415-419.

[13]程志芬，崔连保，玄延花.IL-6和Shh在种植体周围炎龈沟液中的表达及意义[J].口腔医学研究，2018，34（1）：87-89.

[14]赵俊轶，宁红，唐瑜莹，等.IL-6抑制剂Sirukumab治疗类风湿关节炎疗效和安全性的meta分析[J].中国现代应用药学，2020，37（1）：60-68.

[15]桂珍，張淑平，陈小洁.IL-6抑制剂在全身型幼年特发性关节炎治疗中的应用进展[J].现代免疫学，2020，40（2）：174-176，后插1.

[16]余科，贺晓萍，文才，等.IL-6抑制剂控制种植体愈合期炎症性骨吸收的动物实验研究[J].口腔医学研究，2020，36（3）：251-254.

[17]董方，李艳莉，童远武.激光联合牙周基础治疗对种植体周围炎患者龈沟液中TNF-α、b-FGF及IL-1β水平的影响[J].临床和实验医学杂志，2021，20（13）：1447-1450.

[18]郭竹玲，汤涵，黄妙，等.TLR4/NF-κB信号通路在调控牙周炎及高尿酸血症及其相互作用的研究进展[J].中华口腔医学研究杂志（电子版），2021，15（1）：58-62.

[19]杨丕山，宋爱梅.TNF-α/NF-κB信号通路对牙周炎发展和牙周再生的影响及其干预[J].口腔医学，2019，39（1）：1-5.

[收稿日期]2021-08-17

本文引用格式：门贝，朱燕.IL-6抑制剂对种植体周围炎小鼠模型的疗效及其作用机制探讨[J].中国美容医学，2022，31（5）：90-93.