基于网络药理学和分子对接探讨“金银花-连翘”治疗流行性感冒的作用机制

刘馨蔚， 王雪峰

流行性感冒(简称流感)是感染流感病毒引发急性呼吸道症状的疾病，其具有传播快、感染性强的特点。流感患者和隐性感染者为主要传染源，以飞沫传染为主要途径。目前，临床治疗流感首选神经氨酸酶抑制剂，但随着药物使用的增加，其耐药性也在逐年提升[1]。而中医药作为我国医疗特色，在治疗疾病上有独特的优势。其调控机制具有多靶点，多通路，较安全等特点，在改善患儿症状，提高患儿生活质量方面极具潜力。

网络药理学，是生物信息学、医学、计算机科学、现代科学研究方法等集中学科的综合性课程，可以在网络上从多方面来反映药物作用于疾病的机制。这不但与中医学辨证论治的主要思路相符合，还与中医方剂多种成分作用于多个疾病靶点的特点相吻合。故而网络药理学对中药相关科学内涵、新药研发、发展中医药理论等有支持作用。

因此，通过网络药理学和分子对接方法，对“金银花-连翘”的成分及其作用靶点进行研究，从整体观分析“金银花-连翘”[2]调治流感的分子机制，为后续研究提供些许新思路。

1 材料与方法

1.1 “金银花-连翘”靶点筛选 使用中药系统药理学分析平台[3]。从中检索“金银花”“连翘”，获得主要活性成分及作用靶点。设定筛选条件：口服生物利用度≥30%，类药性≥0.18。将筛选结果信息进行规范(使用Uniprot数据库)。

1.2 流感相关靶点筛选 关键词“influenza”，通过OMIM、GKB、GeneCards等数据库进行筛选，获取相关基因，绘制相关靶点韦恩图，去重后得到流感靶点。

1.3 “金银花-连翘”成分-流感靶点图构建 构建“金银花-连翘”成分-流感靶点网络图，使用CytoScape 3.8.0，并分析有效成分、靶点的网络拓扑参数，判断核心靶点。

1.4 “金银花-连翘”成分-流感靶点PPI网络建立 用R语言将流感靶点对接“金银花-连翘”作用靶点，可得“金银花-连翘”活性成分治疗流感潜在作用靶点，绘韦恩图。分析潜在作用靶点蛋白间的相互作用，构建PPI网络，用STRING 11.0数据库[4]将生物种类设定“Homo sapiens”，“highest confidence”即最小互相作用阈值(0.900)，其余不变。通过CytoNA插件对PPI网络进行集中性分析、评估，得到网络核心基因。

1.5 “金银花-连翘”成分-流感靶点功能与通路富集分析 R语言安装Bioconductor中数据包，得到GO富集、KEGG富集和富集结果可视化绘图。

1.6 分子对接 使用PubChem数据库检索主要活性成分，下载相应的SDF文件。ChemBio3D Ultra 14.0软件将下载结构转为3D。PDB数据库，检索“金银花-连翘”成分-流感靶点PPI网络关键靶点，可得蛋白晶体结构，下载PDB格式。所得结构使用Pymol进行优化。用iGemdock找出最佳受体与配体，所得结果使用R语言绘热图。用软件Autodock vina 1.1.2进行半柔性对接，对结合能最低构象进行分析，用Pymol绘图。

2 结果

2.1 “金银花-连翘”活性成分、作用靶点获取 设置口服生物利用度≥30%且类药性≥0.18，通过TCMSP筛选“金银花-连翘”有效活性成分，去重得到43个成分。通过Uiprot数据库限定物种为人后进行检索，“金银花-连翘”潜在作用靶点278个。

2.2 流感相关靶点获取 关键词“influenza”在GeneCards、OMIM、TTD、GKB数据库检索，物种设定“Homo sapiens”，检索GeneCards数据库得到771个相关靶点，检索OMIM数据库得到2个相关靶点，检索TTD数据库得到25个相关靶点，检索GKB数据库得到10个相关靶点，检索DrugBank数据库得到6个相关靶点。将得到的结果绘制韦恩图，见图1。剔除重复靶点，获得794个与“influenza”相关的靶点。

图1 流感相关靶点数据库韦恩图

2.3 “金银花-连翘”成分-流感靶点网络图构建 通过CytoScape 3.8.0绘“金银花-连翘”成分-流感靶点网络图，见图2(封三)。使用内置的CytoNA插件对网络拓扑参数进行分析，得核心活性成分、作用靶点。上述网络分析表明，“金银花-连翘”调治流感的成分连接度前5位包括：槲皮素(quercetin)网络图中连接度34，介度6 447.039，紧密度0.516；木犀草素(luteolin)网络图中连接度19，介度2 463.766，紧密度0.476；芹黄素(apigenin)网络图中连接度19，介度2 774.947，紧密度0.476；乌索酸(ursolic acid)网络图中连接度16，介度2 165.769，紧密度0.45；汉黄芩素(wogonin)网络图中连接度13，介度1 592.857，紧密度0.460。

2.4 “金银花-连翘”成分-流感靶点PPI网络建立 将上述筛选所得活性成分靶点与流感靶点取交集，绘韦恩图，得56个靶点，见图3。靶点提交STRING 11.0平台，获取相应PPI网络，见图4。通过R语言对PPI网络所得的数据根据连接度(Degree)进行网络拓扑分析，见图5。结果可得主要靶点为白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、转录因子P65(RELA)、丝裂原蛋白活化激酶14(mitogen-activated protein kinase14,MAPK14)、JUN。

图3 “金银花-连翘”成分-流感靶点韦恩图

2.5 “金银花-连翘”成分-流感靶点功能与通路富集分析 “金银花-连翘”与流感共同靶点47个，使用R语言Bioconductor安装包，设定程序以pvalueCutoff=0.05、qvalueCutoff=0.05作为条件分析，得到基因本体论(gene ontology,GO)功能富集、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集结果前10条内容并将该内容可视化绘图。KEGG信号通路富集结果中得多个靶点功能与流感紧密相关。药对参与生物学过程主要为对脂多糖应答过程、对细菌起源分子的应答过程、细胞对生物刺激的应答过程等。调节功能主要富集于细胞因子受体结合、泛素样蛋白连接酶结合、细胞因子活性等。参与通路有晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products,AGE)-糖基化终末产物受体(receptor of AGE,RAGE)信号通路、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)信号通路等，同时从富集结果中可看出，相关活性成分还与乙型肝炎、甲型流感、耶尔森菌感染、恰加斯病等疾病相关，详细结果见图6、图7。相关靶点的通路富集结果见表1。

2.6 分子对接结果 PubChem数据库检索“金银花-连翘”成分-流感靶点网络图5个主要活性成分，获得对应结构。ChemBio3D Ultra 14.0软件上述获得结构进行构建，形成3D。PDB数据库检索PPI网络分析得到的5个治疗关键靶点，获得蛋白晶体结构并下载。Pymol对蛋白晶体优化。iGemdock软件对接有效成分小分子和关键蛋白靶点，结果绘制热图，见图8(封三)。根据排序可知有效成分槲皮素(quercetin)与JUN结合最好。Autodock vina 1.1.2行半柔性对接，验证作用力最低结合模式，Pymol绘图，分析表明槲皮素和JUN形成4个氢键，连接的氨基酸残基为ARG-421、ARG-430、HIS-420、LYS-434，氢键用黄色表示长度分别为1.9、2.3、2.3、2.1，见图9(封三)。

表1 “金银花-连翘”治疗流感靶点通路富集结果

图4 “金银花-连翘”-流感靶点PPI网络

图5 PPI网络拓扑分析

图6 金银花-连翘治疗流感的基因本体论富集分析barplot图

图7 京都基因与基因组百科全书通路富集分析dotplot图

3 讨论

流感是一种可在全世界范围内爆发的呼吸道疾病，每年5%～10%成人和20%～30%儿童患病，其中大多为轻症，也出现重症400万例和死亡病例50万左右[5-6]。在我国关于流感的研究中，我国北方省份，辽宁省(2012～2017)12月份至次年3月份流感高发，表现为冬春季单一年度高峰模式[7-8]。山东省济南市(2010～2017)除2011年出现1次夏季7～8月份小流行外，其他年份1月、12月多见[9]。西藏自治区(2013～2016)流感流行季节性为冬、春、夏季节[10]。我国南方省份，长江流域的江苏省(2009～2015)流感每年在1～3月和7～10月存在高峰期[11-13]。可见流感流行性强，对人民身体健康造成危害。在年龄段中，甲型流感病例的年龄相对偏小，乙型流感病例的年龄相对大[14]。

流感属于中医“时行感冒”“重伤风”“温病”等范畴，具有较强的传染性及流行性，且易于传变。其发病机制多由于时邪疫毒流行，人体正气不足，御邪不力，邪毒乘虚入里所致，在疾病初期以外感风邪表证为主，风热毒邪由口鼻而入，侵犯肺卫，使肺气失宣，卫气不畅，出现发热、咽痛等一系列全身症状。“金银花-连翘”此药对为治疗温病初起经典方剂银翘散之君药，同时也是治疗甲型流感的新中药“金花清感方”的重要药味，其中金银花性甘、微苦，清香，辛，寒。归肺、胃、心、大肠经。连翘性平、味苦。入心、肝、胆经。两者同用，共奏疏散风热，清热解毒之功，透散风热表邪的同时亦可辟秽化浊。《素问·至真要大论篇》云：“风淫于内，治以辛凉，佐以苦甘”，“金银花-连翘”依据此而治，对流感病温邪犯肺，热郁肌腠，肺卫失宣者尤宜，故而金银花、连翘抗病毒效用较为确切。同时现代药理学研究表明，金银花总黄酮、绿原酸等具有显著的抗炎作用[15]，体外试验结果证明金银花提取物抑制一氧化氮释放，降低IL-6、IL-1β炎症因子的释放[16]。同时试验研究表明，连翘水提取物、乙醇提取物、挥发油等有抗炎活性，其相关活性单体成分如连翘酯苷、连翘苷及槲皮素等也被证明在有较好抗炎作用[17]。

为了更明确“金银花-连翘”治疗流感的作用机制，为“金银花-连翘”的临床应用提供依据，本次研究借助网络药理学方法来进行分析。通过在TCMID数据库中搜索“金银花”“连翘”筛选分析得到5个主要成分包括槲皮素、木犀草素、芹黄素、乌索酸、汉黄芩素，以槲皮素为主要成分，研究表明其具有抗炎效果可以抑制炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌，同时能够有效降低支气管高反应[18-19]，对症治疗流感有较好的作用；体外试验结果表明，木犀草素能使流感相关基因表达降低，细胞凋亡减低，从而抑制流感病毒[20]。

通过构建“金银花-连翘”成分-流感靶点网络分析得到“金银花-连翘”主要作用的调节靶点为IL-6、JUN、IL-1β、MAPK14、RELA。IL-6可介导炎症反应，其基因编码的IL-6可对宿主免疫应答、炎症反应、血细胞生成和癌发生进行调节。c-jun表达水平多数正常细胞中低，可在炎症介质、炎症细胞、细胞因子刺激作用下激活，激活后可再去激活其他介质、细胞因子，在流感的发病中起重要作用[21]。且目前有研究表明，流感患者气道平滑肌细胞的原癌基因c-jun表达增强，证明c-jun基因表达是气道平滑肌细胞增殖的早期表现之一[22]。由此可见c-jun基因与流感相关度高。IL-1β具有多种生物学效应，是机体一种重要的炎症反应调节因子，国内学者报道在IL-1β基因5′区发现有3个高频SNP位点，并且3个位点之间存在明显的连锁不平衡性[23]。研究发现MAPK家族对细胞生长及分化进行调控，在应激反应如炎症、细胞凋亡等反应中有重要地位[24]。RELA基因编码的宿主蛋白在H5/S诱发更强的宿主先天性免疫反应方面起到关键作用，RELA基因编码转录因子P65蛋白，是构成核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)转录因子亚基之一，NF-κB信号通路是介导炎症反应、病毒感染免疫应答等反应的重要通路[25]。

KEGG富集结果显示代谢通路包括AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等。AGE-RAGE信号通路与IL-1β、TNF-α含量相关[26]，根据最新发现高迁移率组蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)是重要晚期炎症因子，主要存在于真核生物细胞核内，当炎症细胞受到刺激或是内皮细胞受到损伤时，可通过AGE-RAGE信号通路释放至胞外[27]。IL-17信号通路是重要的炎性反应通路，诱导分泌IL-17，同时还与IL-17F、IL-21、IL-22的分泌有关[28]。TNF信号通路也与细胞生长和增殖、炎性和免疫反应密切相关，其作用有调节炎症、免疫和支气管平滑肌[29-30]。

除此之外，根据富集结果显示“金银花-连翘”适用于甲型流感的治疗，同时还可以应用于乙型肝炎、耶尔森菌感染、恰加斯病等疾病的治疗中，这表明“金银花-连翘”可治疗的疾病种类还有待继续挖掘，为未来研究“金银花-连翘”的临床应用提供新思路。

本次研究结果表明“金银花-连翘”在治疗流感过程中，相同化合物可对多个不相同靶点进行调控，而相同的靶点又可以对不相同的信号通路、物学过程进行干预。这与中药的“异病同治”“辨证施治”有异曲同工之处，可以为临床用药提供思路。而本研究未考虑煎煮中药时及煎煮后药物发生的反应，药物进入人体后产生的反应也未进行研究，日后有待进行补充研究。