病理形态学与乳腺癌HER2过表达/扩增的关系

熊怡凡，王晓燕，黄蓉飞，龙小艺，张君莉，蒋安科

(成都医学院临床医学院第一附属医院，四川 成都 610500)

近年来，乳腺癌发病呈现逐年增长及年轻化趋势，其病因尚未完全明确，目前认为，遗传、饮食、激素及外界理化因素均与其发病有关[1].随着分子生物学、肿瘤免疫学的发展，恶性肿瘤的相关研究已步入分子水平阶段，故在诸多病因中，激素受体及基因的表达逐渐受到关注.乳腺上皮细胞在致癌因子作用下出现基因突变，发生无序的恶性增殖，并随淋巴及血液循环在全身播散，形成远处转移，影响预后[2].既往研究[3]发现：在乳腺癌发生、发展过程中存在诸多细胞因子参与，这些细胞因子可在一定程度上反映肿瘤的发展程度及预后情况.人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)为乳腺癌重要的原癌基因，HER2蛋白参与乳腺癌的发生与发展，如今针对HER2基因与蛋白的相关研究已成为热点[4].本研究旨在探讨乳腺癌病理形态学与HER2基因扩增及蛋白过表达的关系.

1 材料与方法

1.1 材 料

纳入2018年6月—2021年6月成都医学院临床医学院第一附属医院90例手术切除的乳腺癌组织标本，获取的乳腺癌组织标本在离体1 h内采用10%福尔马林固定、石蜡包埋.

纳入标准：患者为女性；初发病例；病理确诊为乳腺癌.

排除标准：患者术前曾接受放疗、新辅助化疗等其他治疗；患者病例资料不完整.

1.2 方 法

1.2.1 HER2基因扩增检测

采用荧光原位杂交法(fluorescence in situ hybridization，FISH)进行HER2基因扩增检测.将石蜡包埋的乳腺癌组织连续切片，获得4 μm切片，置于载玻片上，65 ℃烘烤过夜；组织切片采用二甲苯脱蜡处理，分别浸于无水乙醇、85%乙醇、70%乙醇中各2 min，去离子水浸泡3 min，吸除多余水分；切片采用30%酸性硫酸钠处理30 min；2倍柠檬酸钠缓冲液中漂洗2次，5 min/次；0.4 mL蛋白酶K储存液(20 mg/mL)用柠檬酸钠缓冲液稀释，获取蛋白酶K工作液，将组织切片浸泡其中，37 ℃孵育30 min，再用2倍柠檬酸钠缓冲液中漂洗2次，5 min/次；组织切片置于0.1 mmol/L盐酸中浸泡10 min，再用2倍柠檬酸钠缓冲液中漂洗2次，5 min/次；组织切片用-20 ℃预冷的梯度酒精脱水后用丙酮浸泡2 min，自然干燥后加热至56 ℃；在73 ℃的70%甲酰胺变性液中浸泡5 min，采用预冷的梯度酒精脱水，自然干燥后预热5 min，于组织标本杂交区域加入10 μL探针复合物，上盖封边，置于湿盒中42 ℃过夜杂交；分别置于50%甲酰胺、2倍柠檬酸钠缓冲液、0.1% NP-40液、70%乙醇中，自然干燥后加入10 μL DAPI显色液，封片，荧光镜下观察.结果判读：红色信号计数/绿色信号计数>2.2为HER2基因扩增，<1.8为不扩增，18～2.2为不确定[5].

1.2.2 HER2蛋白、雌激素受体、孕激素受体表达检测

采用免疫组织化学法(immunohistochemistry，IHC)进行HER2蛋白、雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)表达检测.将石蜡包埋切片的乳腺癌组织恒温(68 ℃)烘烤30 min，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；3%过氧化氢孵育10 min，PBS冲洗3次，5 min/次；置于枸橼酸抗原修复液，高压锅加热，沸腾15 min，冷却至室温，蒸馏水漂洗2次，PBS冲洗3次，5 min/次；37 ℃下羊血清工作液中封闭30 min，倒除多余液体；加入50 μL一抗，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3次，5 min/次；倒除PBS，滴加50 μL生物素标记的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，5 min/次；倒除PBS，加入50 μL辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，5 min/次；倒除PBS，滴加50 μL新鲜配制的二氨基联苯胺溶液，显微镜下观察染色3 min，冲洗；苏木精复染，冲洗，0.1%盐酸酒精分化，冲洗，PBS返蓝；梯度酒精脱水，干燥封片，光镜下观察.结果判读：HER2表达-：10%以内肿瘤组织细胞膜呈弱棕黄色，或无棕黄染色；+：10%以上肿瘤部分细胞膜呈弱棕黄色；++：10%以上细胞膜呈现完整的弱至中等强度棕黄色；+++：30%以上细胞膜全层高强度棕黄色，以+++为阳性结果.ER、PR表达-：阳性细胞率5%以内；+：阳性细胞率5%～25%；++：阳性细胞率25%～50%；+++：阳性细胞率超过50%[6].

1.3 观察指标

乳腺癌组织样本中HER2基因扩增及HER2蛋白表达情况；采用Spearman秩相关系数分析FISH、IHC两种方法检测结果的相关性，并分析HER2基因扩增/蛋白过表达与患者病理形态学特征的关系.

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 乳腺癌组织样本HER2基因扩增情况

90例乳腺癌组织标本中，FISH检出HER2基因扩增32例，阳性率为35.56%.见表1.

表1 乳腺癌组织样本HER2基因扩增情况Tab.1 HER2 gene amplification in breast cancer tissue samples (n=90)

2.2 乳腺癌组织样本HER2蛋白表达情况

90例乳腺癌组织标本中，IHC检出HER2蛋白过表达24例，阳性率为26.67%.见表2.

表2 乳腺癌组织样本HER2基因扩增情况Tab.2 HER2 gene amplification in breast cancer tissue samples (n=90)

2.3 FISH、IHC检测结果相关性分析

Spearman分析显示：FISH、IHC检测结果存在相关性(P<0.05).见表3.

表3 FISH、IHC检测结果相关性分析Tab.3 Correlation analysis of FISH and IHC test results

2.4 HER2基因扩增/蛋白过表达与患者病理形态学特征的关系

HER2基因扩增、蛋白过表达阳性率在不同年龄阶段、月经状况、病理类型、TNM分期患者中差异均无统计学意义(P>0.05)，在不同组织学分级、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移情况、雌激素受体(ER)表达情况、孕激素受体(PR)表达情况的差异均具有统计学意义(P<0.05).见表4.

3 讨 论

乳腺癌的预后主要取决于早期诊断及有效的治疗方案，尤其对于早期患者而言，除了肿瘤分级等信息之外，明确其个体生物学信息对于治疗方案的选择具有重要意义[7].

HER2是在诸多恶性肿瘤中导致癌变频率较高的原癌基因.HER2原癌基因位于17q21染色体，是一种有酪氨酸激酶活性的生长因子受体，在正常状况下具有调节组织生长的作用，但当其基因结构发生明显改变时，可能影响细胞分裂进程[8].HER2可抑制肿瘤细胞凋亡，并通过调节血管内皮生长因子的表达而促进血管新生，进而促进肿瘤生长，还可使肿瘤细胞具有更强的侵袭性，导致肿瘤发展[9].既往[10-11]报道显示：乳腺癌患者中约有30%存在HER2基因扩增及蛋白过表达，这些患者平均生存期相对较短，且对三苯氧胺等常规治疗药物也表现出明显的耐药性，预后更差，但其对紫杉类、蒽环类药物及曲妥珠单抗联合化疗反应较好.FISH为检测HER2基因扩增的金标准，IHC为检测HER2蛋白表达的最常用手段.本研究显示：90例乳腺癌组织标本中，FISH检出HER2基因扩增32例，阳性率为35.56%；IHC检出HER2蛋白过表达24例，阳性率为26.67%，与既往报道[12]相符.Spearman分析显示，FISH、IHC检测结果存在相关性，故而可将HER2基因扩增或HER2蛋白表达+++作为HER2阳性标志，以此指导临床治疗，对于HER2蛋白表达+、++者建议行FISH检测.

据相关[13]报道，乳腺癌的年轻患者预后不理想，但HER2基因扩增/蛋白过表达与年龄的关系在诸多报道中结论不一.宋天豹等[14]针对原发性乳腺癌的报道显示，HER2过表达与患者年龄呈负相关关系，且可作为HER2基因扩增/过表达的独立相关因素.但本研究结果显示：HER2基因扩增/蛋白过表达阳性率在不同年龄阶段中差异无统计学意义(P>0.05)，提示HER2基因扩增/蛋白过表达与患者年龄无关，分析结论差异可能受年龄分界、样本量等诸多因素的影响.除此之外，HER2基因扩增/蛋白过表达阳性率在绝经前、绝经后、非浸润性、浸润非特异性、浸润特异性患者及TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者之间差异均无统计学意义(P>0.05)，表明HER2基因扩增/蛋白过表达与患者月经状况、病理类型、临床分期均无明显相关性.组织学分级在一定程度上反应肿瘤恶性程度，也是影响预后的关键因素.本研究结果显示：HER2基因扩增/蛋白过表达阳性率在不同组织学分级中差异具有统计学意义(P<0.05)，即随着乳腺癌组织学分级提高，HER2基因扩增/蛋白过表达阳性率随之增加，这一结果与既往研究[15]一致，提示HER2基因扩增/蛋白过表达者肿瘤分化差，预后不佳.本研究显示：HER2基因扩增/蛋白过表达率在不同肿瘤大小之间存在显著差异，肿瘤直径>5 cm者更易出现HER2基因扩增/蛋白过表达，肿瘤直径<2 cm的则阳性率最低.腋窝淋巴结转移是乳腺癌风险评级的重要参考因素，本研究结果显示：乳腺癌伴随腋窝淋巴结转移者HER2基因扩增及蛋白过表达更高，原因可能为HER2基因表达产物具有调节细胞增殖分化的作用，HER2表达阳性者肿瘤细胞之间黏附作用相对更弱，故更容易出现扩散或转移.乳腺癌的发生、发展与性激素的作用密切相关，而ER、PR作为激素受体在其中发挥关键作用[16].既往研究[17]证实：ER、PR表达对乳腺癌治疗方案的选择及预后预测具有重要的指导价值.本研究显示：ER/PR阴性患者HER2基因扩增及蛋白过表达率更高，与既往研究[18]一致，其原因为ER/PR阴性者肿瘤细胞增殖不受激素调控影响，组织分化较差，HER2基因更易出现免疫扩增，继而导致HER2蛋白高表达，而ER/PR阳性者恶性程度一般更低，且对内分泌治疗更为敏感.

综上所述，乳腺癌组织学分级、肿瘤直径、腋窝淋巴结转移及ER/PR受体表达均与HER2基因扩增/蛋白过表达有关，了解HER2表达状况对于乳腺癌的准确诊断及治疗方案的选择具有指导意义.