大豆GmZAT12基因的克隆和表达分析

张晋玉，徐新娟，晁毛妮，张晓红，吴向远，高际涛，黄中文

(河南科技学院，现代生物育种河南省协同创新中心，河南 新乡 453003)

高温、低温、干旱、盐渍等非生物胁迫危害植物生长发育整个过程，影响农作物的产量及品质[1]。由于其固着生长的习性，植物已经在生理生化和分子水平上适应了这些胁迫，使自身在多变的环境条件下得以存活[2]。在胁迫环境下，植物通过一系列信号转导途径激活或抑制转录因子，结合顺式作用元件调控下游抗逆基因实现时空差异表达，从而抵抗不良环境。迄今为止，植物中已鉴定多个抗逆相关转录因子，包括NAC、bZIP、WRKY、AP2/ERF、MYC、bHLH和锌指蛋白等[3-5]。

大豆作为重要的粮食和油料作物，不利的外界环境如干旱和高盐等，对大豆生长发育及高产具有很大威胁。因此，有必要研究大豆应对非生物胁迫的分子机制，提高其抗逆性。本研究克隆了大豆GmZAT12基因，并对其进行生物信息学分析，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测GmZAT12基因在大豆不同组织以及高温、低温、NaCl和ABA处理后的表达变化，旨在为进一步研究大豆GmZAT12基因的生物学功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选用的大豆材料为商豆1201。将大豆种植于大田，在盛花期取根、茎、叶片和花，在鼓粒期取剥去荚皮的大豆种子，用于后续RNA提取、基因克隆和组织表达分析。

1.2GmZAT12基因克隆和表达载体构建

采用植物总RNA提取试剂盒提取大豆RNA(Tiangen，DP432)并逆转录成cDNA。PCR扩增模板为大豆根的cDNA，上下游引物为，F：5′-GCTCTAGAATGAAGAGAGGCAGAGAAGAGG-3′，R：5′-CGCGGATCCAATGAAACAATTGAGGACGG-3′(下划线分别代表酶切位点XbaⅠ和BamH Ⅰ)。采用高保真酶Phanta@ Max Super-Fidelity DNA Polymerase(诺唯赞生物科技有限公司，P505)进行PCR扩增，反应体系按照说明书进行配制。PCR扩增程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，32个循环；72 ℃彻底延伸5 min。PCR胶回收产物和植物表达载体pCambia1305-GFP分别用XbaⅠ和BamH Ⅰ双酶切，连接转化后筛选阳性菌液，提取质粒进行酶切并测序。

1.3GmZAT12的生物信息学分析

GmZAT12基因序列信息由Phytozome网站获得，氨基酸理化性质和潜在磷酸化位点使用ProtParam和NetPhos-3.1进行预测，SOPMA网站分析GmZAT12蛋白二级结构，同时利用MEGA X软件对氨基酸进行多序列比对和进化树构建。

1.4 GmZAT12的亚细胞定位分析

在快代谢组46例中，有2例换用替格瑞洛，没有发生心血管缺血事件；在44例继续口服氯吡格雷的患者中，17例再发心绞痛，其中2例再次靶血管重建。

将测序正确的质粒转化农杆菌感受态细胞GV3101，之后注射烟草叶片，暗培养48 h；使用激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM780)观察GFP荧光在烟草叶片表皮细胞中的分布情况，以pCambia1305-GFP载体为对照。

1.5 非生物胁迫处理

取商豆1201种子种在蛭石中，人工气候室培养条件为光照(28 ℃、16 h)/黑暗(24 ℃、8 h)，湿度70%，待大豆生长至第一对真叶完全展开时进行非生物胁迫处理。将大豆苗分别转移至40 ℃ (高温胁迫)和8 ℃ (低温胁迫)光照培养箱中，在0，2，4，8 h取大豆叶片；NaCl(300 mmol/L)和ABA(100 μmol/L)处理时间为0，2，4，8，24，48 h，取大豆根于冻存管中。液氮速冻后，-80 ℃冰箱保存备用。

1.6 qRT-PCR分析

根据GmZAT12基因序列设计qRT-PCR引物，RT-F：5′-AGGCAGAGAAGAGGGTGAGT-3′，RT-R：5′-CGTGATGCCACGACGAAAGA-3′；以Tubulin基因作为内参，Tubulin-F：5′-GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3′，Tubulin-R：5′-CACTTACGCATCACATAGC-3′。按照SYBR Green Master Mix(诺唯赞生物科技有限公司，Q111)说明书配制反应体系，反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量，使用Origin 2019软件绘图。

2 结果与分析

2.1 大豆GmZAT12基因的克隆

用GmZAT12基因ID号(Glyma.13G333400)检索大豆基因组数据库，得到其CDS序列。以根的cDNA为模板，采用F和R引物进行PCR扩增，获得长度约500 bp的片段(图1)。将PCR产物连接至植物表达载体pCambia1305-GFP，测序结果与大豆基因组数据库参考序列进行Blast比对，结果表明，扩增片段与大豆基因组参考序列一致，GmZAT12基因克隆成功。

M.Marker DL2000；1.GmZAT12。

2.2GmZAT12的生物信息学分析

利用ProtParam对GmZAT12蛋白序列进行理化性质分析，结果表明，GmZAT12基因全长516 bp，共编码171个氨基酸，分子质量为19.264 28 ku，理论等电点(pI)为9.02，不稳定系数为37.00；经NetPhos-3.1预测，GmZAT12蛋白存在12个丝氨酸(Serine)、7个苏氨酸(Threonine)和1个酪氨酸(Tyrosine)磷酸化位点(图2)；通过在线工具SOPMA对GmZAT12蛋白进行二级结构预测，结果显示，GmZAT12蛋白由β-折叠、无规则卷曲、α-螺旋和延伸链组成(图3)，分别占总蛋白质的1.75%，62.57%，21.64%和14.04%。

图2 GmZAT12蛋白的磷酸化位点预测Fig.2 Prediction for phosphorylation sites of GmZAT12 protein

图3 GmZAT12蛋白的二级结构分析Fig.3 Secondary structure analysis of GmZAT12

将GmZAT12与其他植物物种的ZAT蛋白进行氨基酸序列比对，结果发现，这些蛋白质含有2个保守的C2H2锌指结构域(图4)，即GmZAT12的40—64 aa和90—113 aa。从进化树可以看出(图5)，GmZAT12与GmZF1聚为一支；与玉米、水稻、高粱、苜蓿和向日葵相比，大豆和拟南芥的ZAT蛋白亲缘关系更近。

GmZAT12的同源蛋白如下：大豆GmZF1(Glyma.15G040700)、GmZF2(Glyma.12G065800)和GmZAT8(Glyma.11G142500.1)；水稻OsZAT12(XP_015638278.1)和OsZFP16(AAP74357.1)；玉米ZmZAT12(XP_008654280.1)和ZmZAT8(XP_008660288.1)；拟南芥AtZAT11(AT2G37430)、AtZAT18(AT3G53600)、AtZAT12(AT5G59820)和AtZF1(At2G28710)；向日葵HaZAT11(XP_021973789.1)；番茄SlZAT11(XP_004239776.1)；苜蓿MtZAT11(XP_003621801.1)。图5同。

图5 GmZAT12和其他植物ZAT蛋白的进化树Fig.5 Phylogenetic tree of GmZAT12 and other plant ZAT proteins

2.3GmZAT12的组织表达分析

通过qRT-PCR检测GmZAT12在大豆不同组织的表达水平，结果显示，在大豆各个组织中均能够检测到GmZAT12基因表达，其中，根中表达量最高，其次依次是叶片和种子，在花和茎中表达量较低(图6)。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图8—9同。Different lowercase letters indicate significant difference.The same as Fig.8—9.

2.4GmZAT12蛋白的亚细胞定位分析

将植物表达载体pCambia1305-GmZAT12-GFP转化农杆菌GV3101后注射烟草叶片，空载体pCambia1305-GFP为阳性对照。激光共聚焦显微镜下观察GFP分布情况，结果显示，细胞核中可以检测到荧光信号(图7)，说明GmZAT12定位于细胞核。

1.暗场；2.明场；3.融合。1.Dark field；2.Bright field；3.Merge.

2.5GmZAT12在非生物胁迫条件下的表达分析

为了探究GmZAT12如何响应非生物胁迫，利用qRT-PCR技术研究温度、NaCl和ABA处理后该基因的表达变化。从图8-A可以看出，低温处理2 h和4 h后基因上调表达，在处理8 h后基因表达降低；与低温胁迫不同，高温处理2 h后基因表达微弱上调，而在处理4 h后基因的表达量最高，然后下降(图8-B)。

图8 不同温度胁迫处理下GmZAT12的表达分析Fig.8 Express analysis of GmZAT12 under different temperature stress treatments

从图9-A可以看出，NaCl处理GmZAT12基因表达量整体呈现先上升后下降的趋势，处理2 h和4 h后基因表达量升高，并在处理8 h后表达量达到最高，随后表达量降低；ABA处理后基因表达较复杂，处理后2，8，48 h后表达量相对较高，而在处理后4，24 h基因的表达量相对较低(图9-B)。

图9 NaCl和ABA处理后GmZAT12的表达分析Fig.9 Expression analysis of GmZAT12 under NaCl and ABA treatments

3 结论与讨论

锌指蛋白广泛参与植物的生长发育和对环境胁迫的应答反应[6]。本研究从大豆中克隆了一个C2H2型锌指蛋白基因GmZAT12，该基因全长516 bp，编码171个氨基酸，分子质量为19.264 28 ku，pI为9.02。对该基因编码蛋白和其他植物ZAT蛋白进行序列比对发现，GmZAT12含有2个保守的C2H2锌指结构域。进化树分析结果表明，GmZAT12与拟南芥AtZF1和AtZAT12亲缘关系更近，推测它们可能具有相似的功能。亚细胞定位分析显示，GmZAT12蛋白定位在细胞核，与同源蛋白AtZAT12[13]、GmZF1[14]、OsZAT12[15]定位结果一致，而GmZAT12是否具有转录激活或抑制功能、下游靶基因及表达调控机制仍需进一步研究。

GmZAT12在根中表达量最高，其次依次是叶片和种子，而在花和茎中表达量较低，预示该基因可能主要在根和叶片中发挥作用。C2H2型锌指蛋白基因主要参与植物的生长发育及多种逆境胁迫的应答[16-17]。如大豆锌指蛋白基因GmZFP3能够负向调节干旱响应[18]，野生大豆锌指蛋白基因GsGIS3的过量表达提高了拟南芥的铝耐受性[19]。为了探究GmZAT12对非生物胁迫的响应，本研究分析了该基因在不同处理下的表达模式，发现GmZAT12受到高温、低温和NaCl诱导表达。前人研究发现，拟南芥AtZAT12在4 ℃以及38 ℃、NaCl处理后均表现为上调表达[20]，GmZAT12呈现相似变化趋势，棉花GhZAT12在NaCl处理后表达量增加[21]，推测ZAT12在不同物种中对NaCl胁迫具有相似的响应模式。

ABA在低温、干旱、渗透等胁迫信号途径中具有重要的调控作用，并且诱导一系列非生物胁迫响应基因的表达[22-23]，如拟南芥锌指蛋白AZF2在ABA、干旱、NaCl处理后呈现明显的上调表达[24-25]。然而，也有报道发现，有些C2H2锌指蛋白受到脱水、冷胁迫诱导表达，但是并不响应外源ABA[26-27]，暗示植物响应非生物胁迫可能存在2种信号转导途径，即ABA依赖途径和ABA非依赖途径。本研究结果发现，与高温、低温、NaCl处理后上调表达不同，GmZAT12在ABA处理后不同时间点的表达较复杂，呈现上升—下降—上升—下降—上升的趋势。前人研究报道，GmZF1在ABA处理3 h和5 h表达量上升，而在处理12 h表达量下降，处理24 h后表达量再次上升[14]。因此，推测GmZAT12可能与GmZF1相似，依赖ABA信号转导途径响应非生物胁迫。