黔东南三地大叶韭菜总黄酮含量及抗氧化活性研究

胡秀虹，龙杰凤，杨胜舟，万兰，张海兰，王晓铭

（凯里学院，贵州凯里 556011）

韭菜Allium tuberosum属百合科多年生草本植物，味辛、性温，有温中行气、补虚益阳、散瘀解毒之功效，是中国特有的一种药食同源的蔬菜［1-3］.研究表明，韭菜中含硫化物、生物碱、挥发油、黄酮类化合物等多种活性成分［4-6］.大量研究表明［5，7-9］，黄酮类化合物具有抗氧化活性，可用于食品的防腐保鲜［9-10］，还能抑制细胞的凋亡，是治疗心血管疾病药物的主要成分［4，11-12］.

近年来关于韭菜的化学成分、药理学方面的研究较为深入，对于总黄酮的提取及抗氧化性虽有研究，但多数是韭菜籽方面的报道.如孙志勇等对韭菜叶及韭菜籽醇提物进行了抗氧化活性研究，结果显示韭菜籽及韭菜叶醇提液对DPPH·自由基有很好的清除能力［13］.黄锁义等发现，韭菜的黄酮提取物对羟自由基具有很好的清除作用［7］.郭奎彩等［8］研究表明，韭菜籽总黄酮有较强的体外抗氧化作用，能够有效清除DPPH·和·OH，其IC50分别为0.87 μg/mL和3.33 μg/mL.李敬等研究发现，韭菜籽总黄酮对DPPH·和·OH 均具有一定的清除作用，最高清除率分别为82.36%和61.20%［9］.

基于此，本文以黔东南苗族侗族自治州麻江、施秉及丹寨三地的大叶韭菜为研究对象，分析比较其总黄酮的含量差异以及不同部位（根和叶）总黄酮含量的区别，并进一步探究三个地区的大叶韭菜总黄酮的抗氧化活性，旨在为贵州黔东南州大叶韭菜资源的利用以及天然抗氧化剂的开发提供科学依据.

1 实验材料、试剂与仪器

1.1 实验材料与试剂

实验材料大叶韭菜采集于贵州省黔东南州麻江县大叶韭菜种植基地、丹寨县农贸市场和施秉县农贸市场.

实验试剂有芦丁（C≥0.97）、维生素C（C≥0.99）、1，1-二苯肼-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picylhydrazyl，DPPH，C≥0.94），上海源叶生物科技有限公司；亚硝酸钠、冰醋酸、氢氧化铝、三氯化铝、硫酸亚铁，重庆川江化学试剂厂；无水乙醇、无水醋酸钠、过氧化氢、水杨酸，成都金山化学试剂有限公司.

1.2 实验仪器

实验仪器包括UP-6T 优普超UP-6T 型超声波清洗机，上海优普实业有限公司；XFB-500新型密封式粉碎机，吉首市中诚制药机械厂；FA2004 电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；WGLL-230BE电热恒温鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；BIO-BRI酶标仪，成都百乐科技有限公司；BIO-BRI暗箱三用紫外线分析仪，上海嘉鹏科技有限公司；BCD-241TMCN冰箱，青岛海尔股份有限公司.

2 实验方法

2.1 大叶韭菜的前处理

将采集的新鲜大叶韭菜洗净，根、叶分离，分别置于电热恒温干燥箱中45 ℃烘干，粉碎，过60目筛，装入密封袋，置于干燥器中备用.

2.2 芦丁标准曲线绘制

取5 支试管，按表1 的取量精密量取0.2 mg/mL 芦丁标准溶液，依次加入0.1 mol/L AlCl3溶液和pH 为4.8 的HAc -NaAc 缓冲溶液，60%乙醇溶液定容，摇匀.以60%乙醇溶液作为参比，于40℃水浴反应10 min，在407 nm 波长下测定吸光度值，以芦丁溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线图.

表1 芦丁标准稀释溶液的配制

2.3 大叶韭菜总黄酮含量测定

称取大叶韭菜粉末4 g，加80 mL 60%乙醇，超声波提取30 min，抽滤.滤渣相同条件下二次提取，合并两次滤液，保存备用.取提取液1 mL，按照2.2 操作，测定其吸光度，代入标准曲线方程得总黄酮浓度，按公式计算总黄酮得率：总黄酮得率（mg/g）=CV/m.式中C为按标准曲线计算的溶液的总黄酮浓度（mg/mL），V为提取液的体积（mL），m为原料质量（4.0316 g）.

2.4 大叶韭菜总黄酮的薄层层析

在硅胶G薄层板鉴别大叶韭菜黄酮类化合物的存在，以乙酸乙酯∶甲醇∶水（8∶3∶1）作为展开剂，以1%AlCl3溶液作为显色剂于紫外灯下观察其荧光位置.

2.5 大叶韭菜总黄酮抗氧化活性测定

2.5.1 清除DPPH·自由基能力测定

DPPH 分子式为（H6H5）2·N-NC6H2（NO2）3，是一种很稳定的氮中心自由基，其无水乙醇溶液呈紫色，在517 nm 波长处有最大吸收峰，吸光度与浓度呈线性关系.当加入自由基清除剂时，可结合或替代DPPH·，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力.一般清除率越大，抗氧化活性越强.研究表明，黄酮类化合物因含有酚羟基，能与DPPH 反应而清除自由基［9，14-15］.

实验时，按照表2 顺序加样，混匀，超声处理10 min，于25 ℃水浴恒温反应20 min，无水乙醇凋零，于517 nm 处测定各体系的吸光度A，平行实验3次，根据吸光度计算DPPH·自由基清除率，公式如下：DPPH·清除率（%）=［（A2+A3-A1］/A2×100%.式中A1、A2、A3分别为1、2、3反应体系反应结束后，517 nm处的吸光度.

表2 清除DPPH自由基的反应体系

2.5.2 黄酮清除羟基自由基能力测定

羟基自由基（·OH）清除率是反映药物抗氧化作用的重要指标，采用Fenton 反应，利用H2O2与Fe2+混合产生·OH，加入水杨酸捕捉·OH 自由基并产生有色物质2，3-二羟基苯甲酸，该物质在510 nm 处有最大吸收.当向该反应体系中加入具有清除·OH 供能的物质，就会减少·OH 的生成，从而使有色物质的生成量减少，即溶液的A510nm值降低［7，16］.

实验时，参照表3依次在比色管中加入相应溶液.在510 nm 处测定各反应溶液的吸光度，代入如下公式计算羟自由基的清除率：羟自由基清除率（%）=A0-（Ax-Ax0）/A0×100.式中A0为空白对照的吸光度，Ax为样品溶液的吸光度；Ax0为不加显色剂（H2O2）的吸光度.

表3 清除羟自由基的反应体系

3 结果与分析

3.1 芦丁溶液标准曲线

芦丁溶液标准曲线如图1所示，由芦丁标准曲线图可得标准曲线方程为：y=10.083x+0.137 9，R2=0.998 1，线性关系良好.

图1 芦丁溶液标准曲线

3.2 不同地区大叶韭菜总黄酮的含量

表4 是在黔东南麻江县、丹寨县及施秉县三个地区于不同时期采集的大叶韭菜总黄酮的含量测定结果.由表4 可知，麻江县大叶韭菜叶总黄酮含量均值为6.821～7.215 mg/g，根的为0.485～0.534 mg/g；丹寨县大叶韭菜叶总黄酮含量均值为6.416～7.049 mg/g，根的为0.361～0.403 mg/g；施秉县大叶韭菜叶总黄酮含量均值为6.184～7.009 mg/g，根的为0.281～0.339 mg/g.分析实验结果发现，同一地区的大叶韭菜不同部位（根、叶）的总黄酮含量差别较大，其中韭菜叶总黄酮含量远大于根所含总黄酮含量.而不同生长时期的大叶韭菜同一部位的总黄酮含量差别较小，且不同地区的大叶韭菜同一部位的总黄酮含量无显著差异.

表4 不同地区韭菜总黄酮含量

3.3 大叶韭菜总黄酮的鉴别结果

图2 为大叶韭菜总黄酮提取液的薄层层析鉴别结果，图中点样从左往右分别为芦丁标准溶液（1号）、高浓度韭菜提取液（2号）及低浓度韭菜提取液（3号）.由图2可知，三个样品在薄层板上近同一位置均显示有相同颜色的斑点.这说明大叶韭菜提取液中含有黄酮类化合物，随着浓度的升高，斑点颜色越深.此外，相对芦丁标准溶液，2、3号样品的斑点具有明显的拖尾现象，这主要是因为粗取液可能含有其他类化合物造成.

图2 韭菜总黄酮的薄层层析图

3.4 不同地区大叶韭菜总黄酮清除DPPH·自由基的能力

图3 为黔东南麻江县、丹寨县及施秉县三个地区的大叶韭菜（叶）总黄酮提取液对DPPH·自由基的清除率结果.可以看出，三地韭菜叶总黄酮提取液对DPPH·自由基均有较强的清除能力，随着浓度的增加，对DPPH·自由基的清除能力逐渐增强，在接近0.01～0.05 mg/mL 时，其DPPH·清除率分别为40.12%～82.15%、36.85%～79.25%和32.58%～75.39%，DPPH·清除率大小顺序为麻江＞丹寨＞施秉.

图3 三地大叶韭菜（叶）总黄酮提取液对DPPH·的清除率

图4 是三个地区的大叶韭菜（根）总黄酮提取液对DPPH·的清除率.由图4 可知，0.01～0.03 mg/L 时，韭菜根总黄酮提取液对DPPH·自由基的清除率很小，随着浓度逐渐增大，清除率逐渐增大，最大清除率分别为（麻江）37.13%、（丹寨）30.58%、（施秉）23.17%.

图4 三地大叶韭菜（根）总黄酮提取液对DPPH·的清除率

3.5 不同地区大叶韭菜总黄酮清除·OH自由基的能力

图5 是三个地区的大叶韭菜（叶）总黄酮提取液对·OH 的清除率.实验结果显示，三个地区的大叶韭菜叶对·OH 自由基的清除能力在0.01～0.05 mg/mL 时，随着黄酮浓度的增加而增强，其·OH清除率分别为：38.50%～79.17%（麻江）、28.13%～76.13%（丹寨）和26.63%～74.13%（施秉）.

图5 三地大叶韭菜（叶）总黄酮提取液对·OH的清除率

图6 为韭菜根对·OH 自由基的清除能力，由图可知在浓度为0.01～0.06 mg/mL 时，随着韭菜总黄酮浓度增大，三个地区韭菜根对·OH 的清除能力随着增强，·OH 清除率最大的是麻江（56.25%），其次是丹寨（48.35%）和施秉韭菜根（45.68%）.

图6 三地大叶韭菜（根）总黄酮提取液对·OH的清除率

4 结论与讨论

本研究通过测定分析黔东南三个地区的大叶韭菜及其不同部位总黄酮含量，得出同一地区的大叶韭菜不同部位（根、叶）的总黄酮含量差别较大，其中韭菜叶所含总黄酮含量远远大于韭菜根所含总黄酮含量.而不同生长时期的大叶韭菜同一部位的总黄酮含量差别较小，且不同地区的大叶韭菜同一部位的总黄酮含量无显著差异.实验数据显示，麻江的韭菜叶总黄酮含量均值为6.821～7.215 mg/g，根的为0.485～0.534 mg/g；丹寨的韭菜叶总黄酮含量均值为6.416～7.049 mg/g，根的为0.361～0.403 mg/g；施秉的韭菜叶总黄酮含量均值为6.184～7.009 mg/g；根的为0.281～0.339 mg/g.据刘华等［17］报道，采自安顺市的细叶韭菜和韭总黄酮含量分别为3.68 mg/g 和0.53 mg/g，与本研究结果有一定的差别。这说明不同品种韭菜，总黄酮含量也有较大区别.

此外，研究发现，大叶韭菜（根、叶）总黄酮提取液对DPPH·和·OH 有一定的清除作用.在接近0.01～0.05 mg/mL 内，其清除率随着提取液总黄酮浓度的增加而增大，反映了其抗氧化能力与总黄酮浓度有关.实验数据表明，黔东南麻江、丹寨和施秉3 个地区的大叶韭菜（叶）对DPPH·的清除率可高达75.39%～82.15%，对·OH 的最大清除率为74.13%～79.17%；韭菜根对DPPH·的清除率可高达23.17%～37.13%，对·OH 的最大清除率为45.68%～56.25%.这与相关报道基本吻合［7，11，15］.由此可见，大叶韭菜总黄酮作为一种天然、安全的植物提取物，在食品方面，不仅可作为抗氧化剂、防腐剂等食品添加剂开发利用，也可应用于具有抗氧化及抗衰老作用的功能性食品的研发；在医药方面，可应用于抗菌消炎、止咳平喘、抗肿瘤等药物当中.