荧光定量PCR法与免疫组织化学法检测胃黏膜活检标本幽门螺杆菌感染的价值对比

蒋樟英 (福州市中医院，福建 福州 350001)

幽门螺杆菌(Hp)是导致胃炎、胃消化性溃疡等疾病的关键致病菌，和胃癌发生有紧密联系，严重威胁人类生命安全，所以早检出、早治疗对于Hp感染患者很重要。胃黏膜活检标本检测是检测Hp感染主要途径，其中荧光定量聚合酶链反应(PCR)法与免疫组织化学法又是检测胃黏膜活检标本中Hp感染情况主要检测方法，其中免疫组织化学法是将带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应与组织化学的呈色反应，可对相应抗原进行定性、定量[1]，荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中以荧光化学物质检测每次PCR循环后产物总量的方法，以上两种方式在临床应用较为广泛。基于此，本研究就荧光定量PCR法与免疫组织化学法检测胃黏膜活检标本Hp感染的价值对比进行探讨。

1 资料与方法

1.1一般资料 ：经患者及家属同意并签署知情同意书，医院伦理委员会批准将我院2019年3月～2021年3月收治的178慢性胃炎患者的病理活检标本进行收集，均符合胃炎诊断标准[2]且经病理证实。男98例，女80例；男患者年龄38～72岁，平均年龄(54.36±12.16)岁；女患者年龄37～70岁，平均年龄(53.42±11.13)岁。所有患者性别、年龄对比差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法：

1.2.1仪器和试剂：采用免疫组织化学染色仪(Leica BOND-MAX)，全自动荧光定量PCR仪(ABI7500)；试剂盒由Dako公司生产，DNA提取试剂盒(厚生博泰科技)；Hp鉴定试剂盒(达安基因股份)。

1.2.2检测方法：①免疫组织化学法:将所有病理活检标本切取4 μm薄片，设立阴阳性对照；选择免疫组织化学染色仪(Leica BOND-MAX)进行染色，黏膜黏液层、表面、小凹以及腺管表面上皮有棕黄色着色的菌体为Hp阳性。感染强度的判断:观察胃黏膜黏液层、表面、小凹以及腺管表面上皮的Hp菌体，未见Hp则为无；少见或者Hp菌体长度<标本全长的三分之一则为轻度感染(+)；Hp菌体长度介于标本全长的三分之一到三分之二之间则为中度感染(++)；Hp菌体成堆存在并且在整个标本上均有分布则为重度感染(+++)[3]。②荧光定量PCR法：选择全自动荧光定量PCR仪(ABI7500)检测，将标本制成蜡块后切取4 μm薄片装入EP管中，每切取1例标本均用消毒液清洁刀口和周围，避免污染。在加入薄片的EP管中加入TL缓冲液220 μl，90℃下放置60 min，室温放置1 min，1 200 r/min离心2 min，穿过石蜡层抽取200 μl液体于新EP管中，加入40 μl的蛋白酶K，混匀离心收集管盖上液体，55℃下水浴2 h，间隔20 min混匀一次，以组织液完全消化为标准。以1 200 r/min离心2 min，准备一个新的EP管，并将离心后的上清液放置到该EP管中，加入220 μl BL缓冲液和4 μl线性丙烯酰胺，混匀离心，收集管盖上液体，70℃下水浴10 min。加入220 μl无水乙醇，颠倒混匀，将混合液转移至DNA吸附柱中，放置1 min，8 000 r/min离心30 s，弃去滤液，加入500 μl HB缓冲液，放置1 min，8 000 r/min离心30 s，弃去滤液，加入500 μl DNA洗涤液，放置1 min，8 000 r/min离心30 s，弃去滤液，12 000 r/min离心2 min，去除DNA吸附膜上的乙醇。把DNA吸附柱装入新的EP管内，加入70℃预热的洗脱缓冲液50 μl，静置2 min，12 000 r/min离心2 min，将提取完成的组织DNA和配制好的PCR扩增剂混匀，按顺序置于PCR仪上，编辑样本信息，设置循环参数，计算阈值(Ct)和ΔCt，ΔCt>3为+，0<ΔCt≤3为++，ΔCt≤0.00为+++[4]。

1.3观察指标和评价标准:两种检测方式的诊断价值、Hp感染的强度的一致性(Kappa值)以及对轻中重度感染的检出情况。

1.4统计学方法：数据录入SPSS22.0软件中分析，计数资料采用χ2检验，等级资料采用秩和检验，一致性分析采用Kappa检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1荧光定量PCR法和免疫组织化学法对Hp感染的诊断价值比较：荧光定量PCR法阳性率为33.15%，阴性率为66.85%和免疫组织化学法阳性率28.65%，阴性率71.35%对比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 荧光定量PCR法和免疫组织化学法对Hp感染的诊断价值比较[n(%),n=178]

2.2免疫组织化学法和荧光定量PCR法检测Hp感染强度比较： 两种检测方式一致性好，Kappa值为0.610。见表2。

表2 免疫组织化学法和荧光定量PCR法检测Hp感染强度比较

2.3两种检测方式对轻中重度感染的检出比较：荧光定量PCR法较免疫组织化学法分布更均匀，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两种检测方式对Hp感染轻中重度的检出比较[n(%)]

3 讨论

Hp感染是消化内科常见的感染细菌，但感染后通常引起慢性浅表性胃炎而无临床症状，随着时间发展可能会导致胃溃疡以及胃癌[5]，对患者生命安全造成严重威胁，因此有效快速的检出Hp指导对后期对症治疗很重要。临床对于Hp的测定主要通过胃黏膜活检完成，目前对于活检的检测手段多种多样，其中免疫组织化学法利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，从而来确定组织细胞中抗原情况；荧光定量PCR法是一种直接检测核酸的分子生物学技术，通过对提取的DAN进行PCR高效扩增后观察荧光信号，直接进行借助荧光定量，为了寻找一种更为有效的检出方式我院对荧光定量PCR法与免疫组织化学法进行研究。

本研究说明荧光定量PCR法和免疫组织化学法对Hp感染均可进行有效检测。因为免疫组织化学法和荧光定量PCR法均作为一种侵入性检测，其中免疫组织化学法通过抗原抗体反应原理，利用化学反应使标记抗体的显色剂显色对Hp进行分子以及形态检测；荧光定量PCR法通过两条和靶DNA两端互补的寡核苷酸引物，利用酶促反应合成特异片段的体外扩增技术，分析荧光信号变化情况测定是否存在Hp感染，感染时荧光信号出现S型号变化，敏感性以及特异性强。

本研究说明荧光定量PCR法对轻中重度Hp感染的检出效果更好。在本研究中可见，荧光定量PCR法检测分布较均衡，而免疫组织化学法检出的重度较多，而对轻中度的检出较少，说明免疫组织化学法对轻中度的检出可能存在漏诊的情况。因为荧光定量PCR法特异性识别Hp物种特异基因DAN探针以及扩增引物，通过荧光定量仪直接定量核酸数量，反应过程均在封闭管中进行，不受人基因以及其他物种基因影响，因此荧光定量PCR法检测分布较均衡，在张睿祺等[6]人研究中，荧光定量PCR法检出轻、中、重度感染例数分别为6、12、10例，而免疫组织化学法检测轻、中、重度感染例数分别为3、4、16例，说明荧光定量PCR法对轻中重度Hp感染的检出效果更好，支持本研究。

综上所述，荧光定量PCR法和免疫组织化学法均可检测Hp感染，但与免疫组织化学法相比，荧光定量PCR法对轻中重度Hp感染的检出效果更好。