北极海洋来源真菌Aspergillus sp.HDN19-401次级代谢产物的研究

黄璐瑶 张文壮 钱亚 吴家劲 张国建 车茜 李德海 朱天骄

(海洋药物教育部重点实验室，中国海洋大学医药学院，青岛 266000)

极地地区包含南极，北极及其亚区。其环境特殊，具有盐分高，辐射强，光照时间短，永久寒冷，营养物质匮乏的特点，为了适应这种极端的气候条件，极地微生物形成了独特的代谢机制，具有形成新颖代谢产物的潜力，是天然产物研究的重要资源。但由于自然条件恶劣，样品采集困难，极地微生物资源的药用价值研究较少[1-3]。我国在极地微生物药用资源研究方面起步较晚，但发展较为迅速，已成为国际上极地微生物代谢产物研究的重要力量[4-6]，然而目前对北极微生物代谢产物的研究仍然较少，自2013年以来才有少量报道[7]。目前报道的结构类型主要包含萜类[8]、环肽类[9]、聚酮类[10]和生物碱类[11]，这些结构大多具有良好的生物活性，如菌株Eutypellasp.D-1中分离到的化合物eutypenoids B[11]，具有显著免疫抑制活性。菌株Tolypocladium cylindrosporumSCSIO 40433中分离到的化合物cylindromicin[12]，具有显著的酪氨酸酶抑制活性。这些活性天然产物的发现对新药研发具有一定的意义。本文对1株北极沉积物来源真菌Aspergillussp.HDN19-401的代谢产物进行研究，共分离得到9个化合物，通过核磁数据分析和对比确定了它们的化学结构，如图1所示，分别为6-O-methylaverufin(1)[13],6,8-di-O-methylaverufin(2)[14],6,8-di-O-methylnidurufin(3)[14],aversin(4)[15],oxisterigmatocystin A(5)[16],oxisterig-matocystin B(6)[16]，fellutamide C(7)[17],notoamides B(8)[18]和notoamides C(9)[18]。对化合物进行抗真菌，抗细菌以及抗肿瘤活性测试的结果表明，化合物5对蜡状芽胞杆菌，大肠埃希菌有弱的抑制活性，MIC值为25 μmol/L；化合物7对人慢性髓系白血病细胞K562具有中等的抑制活性，IC50值为7.78 μmol/L。

图1 化合物1～9的结构式Fig.1 Chemical structures of compounds 1～9

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

液质联用分析仪Acquity UPLC H-Class coupled to a SQ Detector 2 mass spectrometer (Waters)；Chromaster分析型高效液相色谱仪(日立科学仪器有限公司)；Chromaster半制备型高效液相色谱仪(日立科学仪器有限公司)；Sephadex™ LH-20(Pharmacia公司)；JNM-ECP600型核磁共振仪(日本JEOL公司)；Bruker AV-400MHz超导核磁共振仪(瑞士Bruker公司)；柱色谱硅胶(青岛海洋化工有限公司)；POLAX-L型旋光仪(美国ATAGO公司)；ZF-20C暗箱式紫外分析仪(上海宝山顾村电光仪器厂)；EZ-DRY型冷冻干燥机(美国FTS公司)；EYELAN-N 型旋转蒸发仪(日本东京理化公司)；分析纯、色谱纯试剂(天津市富宇精细化工有限公司)；核磁所用氘代试剂(上海迈瑞尔)。

1.2 菌株

菌株信息：真菌Aspergillussp.HDN19-401(Genbank No.OM390581)，分离自北极LV83-14站位(133°37'1.32''E；77°23'9.12''N)的沉积物样品，菌株存放于中国海洋大学医药学院海洋药用生物资源中心。

菌株发酵：菌株用PDB培养基(马铃薯浸出粉6.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L，海水配制)发酵36 L，室温静置培养30 d。

1.3 提取与分离

发酵后将菌丝体与发酵液分别处理，发酵液加入等体积乙酸乙酯，在搅拌罐中80 r/min搅拌30 min，重复萃取3次后浓缩获得浸膏；菌丝体破碎后加等体积甲醇，超声30 min，萃取3次后浓缩获得浸膏。2个浸膏经HPLC分析，表明成分一致，合并后获得总浸膏11.0 g。经反相硅胶柱色谱梯度(甲醇/水：4:6～10:0)洗脱，分析合并获得12个组分(Fr.1～Fr.12)。Fr.8经半制备高效液相色谱(乙腈/水，70:30)分离获得化合物1(2 mg)；Fr.10经半制备高效液相色谱(甲醇/水，88:12)分离获得化合物2(3 mg)；Fr.7经两次半制备高效液相色谱(甲醇/水，80:20)(甲醇/水，60:40)分离获得化合物3(4 mg)和4(3 mg)以及组分Fr.7-2，Fr.7-2经Sephadex™ LH-20凝胶色谱柱(流动相为甲醇)以及半制备高效液相色谱(甲醇/水，60:40)纯化获得化合物7(4.5 mg)；Fr.6经半制备高效液相色谱(乙腈/水，45:55)分离获得两个组分Fr.6-1，Fr.6-2，Fr.6-1经Sephadex™ LH-20凝胶色谱柱(流动相为甲醇)以及半制备高效液相色谱(甲醇/水，67:33)纯化获得化合物8(3.1 mg)和9(2.3 mg)，Fr.6-2经半制备高效液相色谱(甲醇/水，60:40)分离得到化合物5(10.2 mg)以及组分Fr.6-2-2，Fr.6-2-2经半制备高效液相色谱(乙腈/水，50:50)分离得到化合物6(2.6 mg)。

1.4 活性测试

(1)抑菌活性：采用微量肉汤稀释法，测定化合物对1种真菌，白念珠菌(Candida albicans)以及8种细菌，即副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、蜡状芽胞杆菌(Bacilluscereus)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda，Et)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)的抗菌活性，其中副溶血弧菌为海洋致病菌，真菌阳性对照为制霉菌素，细菌阳性对照为环丙沙星，二甲基亚砜(DMSO)为阴性对照，具体操作见参考文献[19]。

(2)细胞毒活性：采用MTT法，测定所有化合物对人慢性髓原白血病细胞K562和人非小细胞肺癌细胞NCI-H358两种细胞系的细胞毒活性，阳性对照为阿霉素，具体操作见参考文献[20]。

2 结果

2.1 结构鉴定

化合物1：橘红色粉末；阳离子ESI-MS：m/z383.1 [M+H]+，化合物分子式为C21H18O7；1H NMR(600 MHz,d6-DMSO) δH: 14.06 (1H,s,1-OH),7.14(1H,s,H-5),6.95 (1H,s,H-4),6.76 (1H,s,H-7),5.26(1H,d,J=3.0,H-1'),3.88 (3H,s,H-11),2.00 (1H,m,H-4'a),1.98 (1H,m,H-2'a),1.81 (1H,m,H-4'b),1.74(3H,m,H-2'b),1.63 (1H,m,H-3'a),1.51 (3H,m,H-6'),1.42 (1H,m,H-3'b);13C NMR (151 MHz,d6-DMSO)δC: 185.3(C-9),182.2 (C-10),163.5(C-8),158.6(C-1),158.4(C-3),136.6(C-5a),132.3(C-4a),116.2(C-2),109.7(C-1a),108.1(C-5),105.2(C-4),105.0(C-7),100.7(C-5'),66.2(C-1'),56.2(C-11),35.3(C-4'),27.5(C-6'),27.0(C-2'),15.4(C-3')。通过对比文献数据[13]，鉴定结构为6-O-methylaverufin。

化合物2：黄色固体；阳离子ESI-MS：m/z397.4 [M+H]+；化合物分子式为C22H20O7；1H NMR(600 MHz,CDCl3) δH: 13.54 (1H,s,1-OH),7.43 (1H,d,J=2.4,H-5),7.19 (1H,s,H-4),6.76 (1H,d,J=2.4,H-7),5.37 (1H,m,H-1'),4.00 (3H,s,H-11),3.96 (3H,s,H-12),2.05 (1H,m,H-2'a),2.03 (1H,m,H-4'a),1.88 (1H,m,H-2'b),1.81 (1H,m,H-4'b),1.66 (2H,m,H-3'),1.56(3H,s,H-6');13C NMR(151 MHz,CDCl3)δC:186.9(C-9),182.7 (C-10),165.0(C-6),162.9(C-8),159.7(C-3),159.7(C-1),137.7 (C-5a),132.6(C-4a),116.9 (C-2),115.4(C-8a),110.1(C-1a),107.1(C-4),104.9(C-7),104.0(C-5),101.0(C-5'),67.2(C-1'),56.7(C-11),56.1 (C-12),36.0(C-4'),27.9(C-6'),27.5(C-2'),16.1(C-3')。通过对比文献数据[14]，鉴定结构为6,8-di-O-methylaverufin。

化合物3：黄色固体；阳离子ESI-MS：m/z413.1 [M+H]+；化合物分子式为C22H20O8；1H NMR(400 MHz,CDCl3)δH: 13.59 (1H,s,1-OH),7.45(1H,d,J=2.4,H-5),7.22 (1H,s,H-4),6.79 (1H,d,J=2.4,H-7),5.25 (1H,s,H-2'),4.30 (1H,t,H-1'),4.02 (3H,s,H-11),3.98 (3H,s,H-12),2.19 (1H,m,H-4'a),1.93(1H,m,H-4'b),1.74 (1H,m,H-3),1.63(3H,s,H-6');13C NMR (151 MHz,d6-DMSO) δC: 186.4 (C-9),182.1 (C-10),159.3 (C-3),165.5 (C-6),163.6 (C-8),159.4 (C-1),137.1 (C-5a),132.1(C-4a),115.9 (C-2),114.4(C-8a),65.6 (C-1'),110.1(C-1a),105.4 (C-7),105.1 (C-5),106.3(C-4),27.8 (C-4'),56.7 (C-11),57.2 (C-12),71.4 (C-2'),23.3 (C-3'),101.7 (C-5'),30.8 (C-6')。通过对比文献数据[14]，鉴定结构为6,8-di-O-Methylnidurufin。

化合物4：黄色固体；阳离子ESI-MS：m/z369.1 [M+H]+；化合物分子式为C20H16O7；1H NMR(400 MHz,CDCl3)δH: 13.50 (1H,s,1-OH),7.21 (1H,s,H-4),7.44 (1H,d,J=2.4,H-5),6.77 (1H,d,J=2.4,H-7),6.44 (1H,d,J=5.7,H-1'),4.15 (1H,dd,H-2'),4.15 (1H,dd,J=8.3,J=6.0,H-4'a),4.02 (3H,s,H-11),3.98 (3H,s,H-12),3.66 (1H,dd,H-4'b),2.35 (1H,dd,H-3'a),2.26(1H,dd,H-3'b);13C NMR (101 MHz,d6-DMSO) δC:186.4(C-9),181.9(C-10),165.2(C-3),164.7(C-6),163.4(C-8),159.8(C-1),136.8(C-5a),134.6(C-4a),120.7(C-2),113.9(C-8a),113.5(C-1'),112.4 (C-1a),105.1(C-7),104.8(C-5),100.1(C-4),67.6(C-4'),57.0(C-11),56.6(C-12),44.1(C-2'),30.7(C-3')。通过对比文献数据[15]，鉴定结构为aversin。

化合物5：黄色固体；阳离子ESI-MS：m/z387.5 [M+H]+；化合物分子式为C20H18O8；1H NMR(400 MHz,d6-DMSO)δH: 12.71 (1H,s,8-OH),7.38 (1H,d,J=8.9,H-6),6.65 (1H,d,J=8.9,H-7),6.62 (1H,s,H-2),6.59 (1H,d,J=6.1,H-1'),5.25 (1H,d,J=4.7,H-4'),4.21 (1H,dd,J=6.5,8.9,H-2'),3.88 (3H,s,1-OCH3),3.87 (3H,s,5-OCH3),3.09 (3H,s,4'-OCH3),2.76 (1H,s,H-3'a),2.28 (1H,s,H-3'b);13C NMR (151 MHz,d6-DMSO)δC: 180.9(C-9),165.5(C-3),163.4(C-1),154.7(C-8),153.6 (C-10),144.5(C-13),139.6(C-5),121.3(C-6),114.3(C-1'),109.6(C-11),109.2(C-7),108.4 (C-4),106.9(C-4'),105.2(C-12),91.3(C-2),58.0(5-OCH3),57.2(1-OCH3),55.1(4'-OCH3),42.5(C-2'),36.8(C-3')。通过对比文献数据[16]，鉴定结构为oxisterigmatocystin A。

化合物6：黄色固体；阳离子ESI-MS：m/z387.5 [M+H]+；化合物分子式为C20H18O8；1H NMR(400 MHz,d6-DMSO)δH: 12.67 (1H,s,8-OH),7.39(1H,d,J=9.0,H-6),6.68 (1H,d,J=8.8,H-7),6.66(1H,s,H-2),6.52 (1H,d,J=5.9,H-1'),5.18 (1H,t,J=5.0,H-4'),4.27 (1H,m,H-2'),3.89 (3H,s,1-OCH3),3.88 (3H,s,5-OCH3),2.54(3H,S,4'-OCH3),2.43(1H,m,H-3'a),2.21 (1H,m,H-3'b);13C NMR(151 MHz,d6-DMSO)δC: 180.9(C-9),165.3(C-3),163.6 (C-1),154.6(C-8),154.3(C-10),144.5(C-13),139.7(C-5),121.4(C-6),112.2(C-1'),109.6(C-11),109.4(C-7),107.3(C-4),107.1(C-4'),105.7(C-12),91.5(C-2),58.1(5-OCH3),57.3(1-OCH3),56.6(4'-OCH3),42.5 (C-2'),36.3 (C-3')。通过对比文献数据[16]，鉴定结构为Oxisterigmatocystin B。

化合物7: 浅紫色固体；阳离子ESI-MS：m/z558.7[M+H]+；化合物分子式为C27H51N5O7；1H NMR(400 MHz,d6-DMSO)δH: Lol: 3.28 (1H,m,H-1a),3.18(1H,m,H-1b),3.77 (1H,m,H-2),1.27-1.38 (2H,m,H-3),1.57(1H,m,H-4),0.81(1H,d,H-5),0.86 (1H,m,H-6); Gln: 7.44(1H,d,7-NH),1.71(1H,m,H-15a),1.71(1H,m,H-15b),4.09(1H,m,H-9),1.91 (1H,m,H-10a),1.71 (1H,m,H-10b),2.06(2H,m,H-11),7.20(1H,s,13-NH2a),6.74(1H,s,13-NH2b); Asn:7.99(1H,d,J=7.0,H-14),4.47(1H,q,J=6.7,H-16),2.55(1H,d,J=6.6,H-17a),2.44(1H,d,J=6.8,H-17b),7,41(1H,s,H-18),6.94(1H,s,H-19a),8.10(1H,d,J=7.4,H-19b); 3-HAD: 2.20(2H,m,H-22),3.77(1H,m,H-23),1.24-1.38(2H,m,H-24-31),0.86(2H,d,H-32),4.55(1H,t,J=5.7,1-OH),4.64(1H,d,J=5.0,23-OH);13C NMR (151 MHz,d6-DMSO)δC: 64.3(C-1),49.3 (C-2),40.6 (C-3),24.0 (C-4),22.4 (C-5),22.6 (C-6),171.1(C-8),53.2 (C-9),28.3 (C-10),32.0 (C-11),174.5 (C-12),171.5 (C-15),50.4 (C-16),37.5 (C-17),172.3(C-18),171.8 (C-21),44.0 (C-22),68.0 (C-23),37.4 (C-24),25.7 (C-25),29.7 (C-26),29.6 (C-27),29.5 (C-28),29.3(C-29),31.9 (C-30),21.8 (C-31),14.5 (C-32)。通过对比文献数据[17]，鉴定结构为fellutamide C。

化合物8: 黄色固体；阳离子ESI-MS：m/z448.4[M+H]+；化合物分子式为C26H29N3O4；1H NMR(600 MHz,d6-Acetone)δH: 9.52 (1H,s,H-1),7.09(1H,d,J=5.4,H-4),6.41 (1H,d,J=5.4,H-5),2.22(1H,d,J=9.7,H-10a),3.03 (1H,d,J=9.4,H-10b),3.45 (1H,m,H-14a),3.51(1H,m,H-14b),1.83(1H,m,H-16a),2.67(1H,m,H-16b),8.03(1H,s,H-19),1.83 (1H,m,H-20a),2.02(1H,m,H-20b),3.37(1H,m,H-21),0.80(3H,m,H-23),0.83(3H,m,H-24),6.65(1H,d,J=6.6,H-25),5.75(1H,d,J=6.5,H-26),1.40(3H,s,H-28),1.41(3H,s,H-29);13C NMR(151MHz,d6-Acetone)δC: 184.1 (C-2),62.6(C-3),127.5(C-4),109.7(C-5),153.8(C-6),105.8(C-7),139.3 (C-8),123.6 (C-9),34.9 (C-10),67.1 (C-11),170.5 (C-12),44.4 (C-14),25.5 (C-15),30.4 (C-16),69.4(C-17),174.2(C-18),31.1(C-20),56.9(C-21),46.4(C-22),23.9(C-23),20.4(C-24),117.7(C-25),131.3(C-26),76.7(C-27),28.1(C-28),28.1(C-29)。通过对比文献数据[18]，鉴定结构为notoamides B。

化合物9: 黄色固体；阳离子ESI-MS：m/z450.5[M+H]+；化合物分子式为C26H31N3O4；1H NMR (600 MHz,d6-Ace-tone)δH: 9.88 (1H,s,H-1),7.03(1H,d,J=5.4,H-4),6.36 (1H,d,J=5.4,H-5),2.51(1H,m,H-10a),2.48 (1H,m,H-10b),3.93(1H,m,H-11),3.22 (1H,m,H-14a),3.38(1H,m,H-14b),1.71(1H,m,H-15a),1.71(1H,m,H-15b),1.30(1H,m,H-16a),2.01 (1H,m,H-16b),3.89 (1H,m,H-17),5.01(1H,d,J=11.6,H-20a),5.06(1H,d,J=7.4,H-20b),6.14(1H,dd,J=7.4,11.6,H-21),1.02(3H,s,H-23),1.09(3H,s,H-24),6.63(1H,d,J=6.6,H-25),5.75(1H,d,J=6.6,H-26),1.40(3H,s,H-28),1.42(3H,s,H-29);13C NMR(151 MHz,d6-DMSO)δC: 180.9 (C-2),56.0 (C-3),127.7(C-4),107.9(C-5),152.6(C-6),104.7(C-7),139.7 (C-8),120.9(C-9),30.5 (C-10),53.5(C-11),165.0 (C-12),45.2 (C-14),22.1 (C-15),29.3 (C-16),58.5 (C-17),168.8(C-18),113.8 (C-20),143.9 (C-21),42.7(C-22),21.6(C-23),22.6(C-24),117.5(C-25),129.2(C-26),76.2(C-27),28.0(C-28),28.2(C-29)。通过对比文献数据[18]，鉴定结构为notoamides C。

2.2 化合物生物活性测试

采用微量肉汤稀释法对所有化合物进行抑菌活性测试，结果表明化合物5对蜡状芽胞杆菌，大肠埃希菌有弱的抑制活性，MIC值为25 μmol/L，其余MIC值均大于或等于50 μmol/L。细胞毒活性结果显示化合物7对K562细胞具有中等抑制活性，IC50值为7.78 μmol/L。

3 讨论

本文对北极来源真菌Aspergillus sp.HDN19-401的次级代谢产物进行了研究，共分离得到9个化合物，除化合物2曾从一株南极来源曲霉属真菌中分离得到外[21]，其余均为首次从极地来源真菌中获得。根据文献报道，化合物7对人肺腺癌细胞A549，人卵巢腺瘤细胞SK-OV3，人恶性黑色素瘤细胞SKMEL-2，人中枢神经系统癌细胞XF498，人结肠癌细胞HCT15中的大多数都具有细胞毒性，且对后三者更为敏感(ED50＜5.1 µg/mL)[17]，而7对K562细胞的活性为首次报道。化合物8和9对人宫颈癌细胞HeLa 229和小鼠白血病细胞L1210细胞系具有中等的细胞毒性，IC50值为22～52 µg/mL[18]。化合物5和6为sterigmatocystins类化合物，此类化合物对动物具有致癌性，可诱导大鼠肝细胞癌，鳞状细胞癌，已被公认为2B类致癌物[22]。相比于其他具有类似结构的海洋来源的曲霉属真菌[23-24]，菌株Aspergillussp.HDN19-401具有更高的化合物多样性。研究结果初步表明，极地来源真菌能够产生结构多样的代谢产物，具有较大的化合物发掘潜力，值得深入开展代谢潜能挖掘的研究。