止咳化痰合剂对慢性阻塞性肺疾病大鼠炎症损伤的保护作用

谢轶群，鞠秋燕，周 翔，韩林华，王雪芹，王 婧（如皋市中医院，江苏 如皋 226500）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）由多种原因诱发肺部慢性异常炎症反应所致，受遗传和环境因素影响。 COPD的特征是逐渐加重和不完全可逆的气流阻塞[1-2]。目前，吸烟被认为是COPD的重要诱因。长期的炎症刺激可能会导致炎症细胞（例如中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞）的浸润，从而释放多种炎症细胞因子参与肺部炎症反应[3]。宿主防御可分为先天性和适应性免疫系统反应。先天免疫系统可以通过Toll样受体与微生物中高度保守的分子相互作用而迅速做出反应，例如：TLR-4识别革兰阴性菌的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）并与其表位结合后激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路，调节细胞因子、趋化因子和促炎基因的表达[4-5]。同时，COPD 患者的TLR4和NF-κB（p65）蛋白异常激活[6]。

止咳化痰合剂为我院院内制剂（ZKHT，苏药制字Z04001602），组方含陈皮、桔梗、前胡、白前、紫苑、法半夏、浙贝母、连翘、黄芩、苦杏仁、生甘草。主要功效为清肺、止咳、化痰。有研究[7]表明，在COPD患者的临床治疗中加用止咳化痰合剂，可优化患者的治疗效果，改善肺功能，减轻气道炎症反应，提高气道清除率。然而，关于止咳化痰合剂的具体的生物学机制尚未阐明，本研究通过构建COPD大鼠模型，观察其肺部病理学变化、炎症反应及氧化应激改变情况，探索止咳化痰合剂对COPD大鼠炎症损伤的保护作用及其机制，为药物的合理开发和利用提供新思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物

依托南通大学，选用清洁级健康SD大鼠32只，动物生产许可证号：SCXK（苏）20190001；动物使用许可证号：SYXK（苏）2017-0045。采用烟雾吸入加LPS灌肺复合因素建立COPD大鼠模型[8]。在造模的第1天、第14天对大鼠行1%戊巴比妥钠2.4 mL·kg-1腹腔注射麻醉后，暴露喉头，以静脉套管针替代气管导管行气管插管，向大鼠气管内注入LPS 200 μg，完毕后将大鼠直立旋转5 ～ 10 s（旋转速度：1 周·s-1），使LPS 均匀分布于肺部。第2 ～ 13天、第15 ～ 28 天，每日在有机玻璃密闭箱（80 cm×60 cm×50 cm，4 个侧面均有一直径为1 cm 的通气孔）中持续吸入新鲜的香烟雾30 min，10支·d-1，造模28 d 结束。对照组仅在第1天和第14 天予气管内滴注等量的0.9%氯化钠注射液，置于正常无烟环境中饲养。

1.2 仪器与试药

止咳化痰合剂为我院院内制剂（ZKHT，苏药制字Z04001602）；LPS（Sigma公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde， MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α） ELISA检测试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司）；兔单抗TLR4和GAPDH（Abcam公司）；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）标记的山羊抗兔IgG Ⅱ抗（武汉赛维尔公司）。

1.3 给药方法

将32只大鼠分为对照组、COPD组、COPD +ZKHT低剂量组、COPD + ZKHT高剂量组。未做任何处理的大鼠作为对照组，造模成功的大鼠随机平均分为COPD组、COPD + ZKHT低剂量组、COPD +ZKHT高剂量组。对照组和COPD组大鼠正常饲养，每日灌服等量0.9%氯化钠注射液。止咳化痰合剂成人每日用量为150 mL，大鼠（体质量200 g）用量=0.018×成人用量（体质量70 kg）。该方法计算结果为中剂量，其1/2 剂量为低剂量组，2 倍剂量为高剂量组。

1.4 肺组织学检查

LPS给予24 h后注射水合氯醛处死大鼠，采用0.01 moL·L-1磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）灌注10 min，再灌注4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）15 min。 采集的肺组织用4% PFA固定24 h，石蜡包埋，切片成5 μm切片，HE染色，光镜下观察。 通过在盲测中由两名病理学家对组织学标本进行评分，对图像进行形态学评估。观察是否有水肿、充血和充血、中性粒细胞边缘和组织浸润、肺泡内出血和碎片以及细胞增生现象并根据严重程度给予相应评分：不存在（0分）、轻度（1分）、中度（2分）和重度（3分），并计算每只动物的总分[9]，评分越高说明组织损伤越严重。

1.5 支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的收集和分析

在LPS攻击后24 h注射水合氯醛处死大鼠。将 7号针插入尾静脉并收集血液进行测试[10]。将钝性7号腰椎穿刺针插入气道并用金属丝固定，通过钝性解剖分离大鼠气管。滴注 5 倍体积的 5 mL 0.9%氯化钠注射液，轻轻吸出、汇集并再次吸出。于4 ℃下以2990 r·min-1离心10 min，四组之间在肺灌洗过程后回收的BALF总体积没有差异。收集上清液并于-80 ℃储存。使用ELISA试剂盒根据说明书测定BALF中炎性因子TNF-α、IL-1β的水平。沉淀的细胞用0.01 moL·L-1PBS重悬，然后以2990 r·min-1离心10 min。将10 μL沉淀的细胞涂在载玻片上并通过吉姆萨染色。用光学显微镜拍摄图像以观察细胞类型和形状。

1.6 氧化水平标志物的活性测定

脂质氧化水平的标志物采用MDA活性测定法测定，抗氧化水平的标志物采用SOD活性测定法测定。LPS 攻击后 24 h，注射水合氯醛处死大鼠，收集右下叶肺样本并在冷 PBS中匀浆。收集100 μg肺组织并立即予4 ℃下在1 mL PBS中匀浆，后以4400 r·min-1离心15 min。收集上清液用于检测MDA和SOD水平。然后使用测定试剂盒测量SOD活性（U·mL-1）和MDA浓度（nmol·mg-1）。分别通过光谱法在532 nm和550 nm处测量MDA和SOD的吸光度。MDA和SOD的水平通过每个吸光度计算。

1.7 免疫组织荧光染色

在大鼠左肺的石蜡包埋切片（5 μm）依次脱蜡脱二甲苯，随后加入TLR-4的一抗，并在4 ℃下孵育过夜。加入FITC标签的山羊抗兔二抗溶液反应，DAPI复染细胞核。然后将切片用乙醇脱水，用中性树胶密封，在显微镜下观察。

1.8 蛋白质印迹检测

将右肺组织切片加入裂解液裂解。将匀浆离心10 min，分离上清液，然后在562 nm波长下测量蛋白质浓度。随着SDS-PAGE凝胶的制备，每孔上样10 μL蛋白质。电泳后，将目标蛋白范围内的凝胶切掉，移到NC膜上，用5%脱脂牛奶密封2 h。用 PBS-T缓冲液洗脱3次（每次3 min）后，加入TLR-4一抗并在4 ℃下孵育。后用 PBS-T洗脱3次（每次3 min），加入二抗孵育2 h，然后用另一轮PBS-T缓冲液洗脱3次（每次3 min）。ECL显影后，使用凝胶成像仪进行曝光显影。

1.9 统计分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间数据采用独立样本t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析。P＜ 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 组织病理学检查

组织病理学检查显示，对照组大鼠肺组织表现为较典型的正常结构，肺泡壁薄，肺间质和肺泡间隙无中性粒细胞浸润，肺脏组织学评分（0.37±0.09）分。COPD造模成功的大鼠肺泡壁增厚、肺间质和肺泡间隙中有中性粒细胞浸润、实变和肺泡出血。COPD组肺脏组织学评分为（4.24±0.36）分，显著高于对照组（P＜ 0.001），与COPD组相比，止咳化痰合剂治疗减少了浸润的炎症细胞并显着改善了肺结构，且应用止咳化痰合剂后肺组织评分显著降低，高剂量组的组织学评分为（1.33±0.21）分，显著优于低剂量组[（2.81±0.25）分，P＜ 0.01]。

2.2 BALF分析

通过ELISA法分析BALF中的炎性因子IL-1β和TNF-α的水平，结果显示，COPD组的BALF中，IL-1β和TNF-α水平显著高于对照组，而应用止咳化痰合剂后，上述炎性因子指标均显著回落，其中高剂量的疗效优于低剂量。随后，采用Giemsa染色观察BALF中炎症细胞的类型和形状。结果显示，止咳化痰合剂治疗显著降低了COPD大鼠BALF中中性粒细胞和淋巴细胞的总数和类型。见表1。

表1 各组大鼠BALF 中IL-1β及TNF-α水平. n = 8，ng·mL-1Tab 1 IL-1β and TNF-α levels in BALF of rats in each group. n = 8, ng·mL-1

2.3 止咳化痰合剂的抗氧化作用

为了探索止咳化痰合剂对COPD大鼠肺保护作用的潜在机制，本研究测量了MDA和SOD水平。如表2所示，与对照组相比，COPD组MDA表达显著升高，SOD表达显著降低。与COPD组相比，止咳化痰合剂组SOD活性升高，MDA活性显著降低，同时止咳化痰合剂COPD大鼠肺的抗氧化作用呈剂量依赖性。

表2 各组大鼠肺SOD及MDA水平. n = 8Tab 2 Levels of SOD and MDA in lung of rats in each group. n = 8

2.4 肺组织TLR4蛋白表达

肺组织的免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹实验的结果显示，对照组大鼠肺组织中TLR4的蛋白表达水平相对较低[（100.00±12.35）%]。与对照组相比，COPD组大鼠肺组织中TLR4蛋白表达增加[（446.01±32.19）%，P＜ 0.001]，给予止咳化痰合剂后，与COPD组相比，低、高剂量组大鼠肺组织中TLR4蛋白表达均显著降低[（303.97±17.39）%vs（147.62±18.90）%]并呈现剂量-效应关系，高剂量组中TLR4蛋白表达显著低于低剂量组（P＜ 0.05）。

3 讨论

COPD是一种在全球范围内发病率和死亡率都很高的疾病，其发病机制尚不明确，目前普遍认为吸烟等行为会诱发有害气体或颗粒物引起的肺部异常炎症反应，是造成COPD的原因之一。本研究采用吸烟和脂多糖方法诱导COPD疾病动物模型，模型组大鼠肺部有显著的病理损害（如炎症浸润和纤维化的发展），并显著增加COPD大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β等炎症细胞因子的分泌，这与以往文献[11]报道结果一致，提示大鼠COPD模型建立成功。

有研究[12]表明，在脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠模型中，用自由基清除剂预处理可有效减少BALF炎症细胞因子的释放，并减轻肺损伤的程度。本实验以肺组织中MDA和SOD的含量作为反映氧化应激和肺组织损伤程度的指标。MDA是由细胞膜和线粒体膜发生的脂质过氧化产生的，直接反映了体内活性氧的活性和数量，间接反映了细胞损伤的程度。SOD是一种重要的抗氧化酶，能消除超氧阴离子，减少原型亚硝酸盐形式造成的损伤，对肺有保护作用。SOD的表达水平与肺损伤程度呈显著负相关，而氧化应激的产物会降低SOD的活性[13]。与其他炎性疾病类似，COPD的特征是炎症细胞因子在气道中的积累和激活，这些细胞因子对诱导炎症至关重要，包括TNF-α、IL-1β。本研究结果显示，止咳化痰合剂显著下调了炎症细胞因子和TLR-4蛋白表达，说明止咳化痰合剂能有效抑制COPD引起的炎症介质的释放，可以通过抑制TLR4信号通路来干预COPD的反应，从而改善肺的病理损伤。

综上所述，止咳化痰合剂可减轻肺组织充血、水肿、炎症细胞浸润症状，发挥抗炎、抗氧化作用，改善肺病理损害，同时抑制TNF-α、IL-1β的表达，下调TLR-4蛋白的表达。本研究结果为止咳化痰合剂应用于临床中治疗COPD提供了实验数据。