基于谱-效关系分析唐古特大黄的潜在抗菌活性成分

王明阳，张 博，刘 悦，张 宏2，，丁功涛，齐燕姣2，*

（1.西北民族大学 化工学院，甘肃 兰州 730000；2.环境友好复合材料国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省高校环境友好复合材料及生物质利用省级重点实验室，甘肃 兰州 730000；4.西北民族大学 生物医学研究中心，甘肃兰州 730000）

【研究意义】蓼科植物大黄用药历史悠久，主要包括掌叶大黄（Rheum palmatumL.）、唐古特大黄（R.tanguticumMaxim.ex Balf.）和药用大黄（Rheum officinaleBaill）。其中，唐古特大黄生长条件特殊，主要分布于甘肃、青海和西藏等高寒地区，所含化学成分与其它两种大黄有差异性，主要体现在一些鞣质、苯丁酮苷和二苯乙烯类成分[1-2]。研究[3-9]表明，唐古特大黄中的化学成分主要有蒽醌类、吡喃酮类和鞣质类等，并且大黄素甲醚已经被鉴定和登记。药理学实验表明，唐古特大黄除具有泻热通便、凉血解毒、逐瘀通经和免疫调节的功效外，还具有很好的抗菌活性[10-12]。由于我国大黄的产地不同、采收时间不同和加工方式不同会严重影响大黄的成效，因此通过指纹图谱的研究来对其质量进行评价具有重要意义。【前人研究进展】李丹丹等[13]采用HPLC 法建立不同来源及不同产地的大黄的指纹图谱，并对主要成分含量进行测定，结果表明栽培掌叶大黄、野生掌叶大黄、药用大黄、唐古特大黄被明显区分开，没食子酸、儿茶素、大黄酸-8-O-葡萄糖苷等对大黄的一致性差异影响较大；王荣等[14]采用HPLC 法研究甘肃道地药材大黄不同部位提取物的指纹图谱，结果表明大黄不同部位的图谱差异明显，有效成分大黄素、大黄酚等含量差别最大；杜清涛等[15]对不同品种和不同产地的大黄进行了UPLC指纹图谱的研究，结果表明3个品种大黄对照药材区别特征明显，经对照品对比及液质分析确定了其中14个峰的成分；陈斌等[16]建立了不同产地掌叶大黄HPLC 指纹图谱的共有模式，将有效成分进行了很好地分离，并对其他产地药材进行了相似度比较。董瑞珍等[17]通过对不同来源的掌叶大黄、唐古特大黄进行指纹图谱分析，认为该方法可以为大黄质量监控提供基础数据。袁振海等[18]通过指纹图谱及含量测定研究不同基原及批次的大黄药材，认为单纯依靠指纹图谱相似度来评价药材质量具有一定局限性，需辅助其他特征及统计学进行综合评价。然而，大黄指纹图谱的研究仅仅能够根据化学成分的稳定性从整体上对中药的质量进行控制，而并没有与中药的药效建立直接的内在联系。随着化学农药减施、增效政策的提出，植物源杀菌剂具有物安全、低毒、低残留及种类多样等优点，成为新型农药研究开发的热点之一。大黄因具有很好的抗菌效果逐渐引起了人们的重视[19-21]，其中，大黄素甲醚对水稻叶瘟病、穗瘟病和小麦赤霉病有良好的防治效果[22-23]。此外，大黄素对魔芋软腐病菌和猕猴桃溃疡病菌均表现出很好的防治作用[24]。【本研究切入点】然而，大黄化学成分复杂，其在植物源病原菌中的防治作用和有效成分的挖掘还有待于进一步研究。此外，由于中药化学成分不同导致不同溶剂的提取物会对药效产生较大的影响。研究显示大黄醇提物对大肠杆菌的抑菌效果好，但其水提物对大肠杆菌的抑菌作用较差[25]。张莉等[26]采用水煎法、半仿生法、乙醇回流法、超声－微波协同萃取法、微波萃取法、水提醇沉法等6种方法制备了包括大黄在内的6种中药原液，实验证明它们对不同细菌的抗菌活性略有差异。【拟解决的关键问题】本文选取植物细菌性软腐病和黑腐病的主要致病菌胡萝卜软腐果胶杆菌、野油菜黄单胞菌以及常见金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为指示菌，采用HPLC 建立了唐古特大黄不同溶剂提取物的指纹图谱，测试了提取物对4 种细菌的抑菌活性，并将指纹图谱中的化学成分与抑菌药效信息进行关联，以期为大黄防治食源性软腐病及其质量标志物的筛选提供参考信息。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

1.1.1 仪器 高速多功能粉碎机（WJX-200，上海缘沃工贸有限公司）；循环水式多用真空泵（SHB-III，郑州长城科工贸有限公司）；旋转蒸发仪（RE-52，上海亚荣生化仪器厂）；立式压力蒸汽灭菌器（YXQLS-100A；上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；恒温培养摇床（THZ-100（THZ-98B），上海一恒科学仪器有限公司）；智能型垂直流超净工作台（ZHJH-C1106C，上海一恒科学仪器有限公司）；恒温培养振荡器（ZWYR-2401，上海智城分析仪器制造有限公司）；高效液相色谱仪（1620，安捷伦科技有限公司）。

1.1.2 材料 唐古特大黄购自甘南百草公司，经西北民族大学化工学院罗兴平教授鉴定，为正品；提取溶剂：丙酮（分析纯）、乙醇（分析纯）、乙酸乙酯（分析纯）、正丁醇（分析纯）均购自西安天茂化工有限公司；甲醇（高效液相色谱级）购自天津市科密欧化学试剂有限公司；磷酸（分析纯）购自天津市富宇精细化工有限公司；芦荟大黄素（批号110795-201308，纯度≥97.8%）、大黄酚（批号110796-201520，纯度≥99.2%）、番泻苷B（批号110825-201502，纯度≥98.0%）、没食子酸（批号110831-201605，纯度≥90.8%）、儿茶素（批号110877-201604，纯度≥99.2%）、番泻苷A（批号110824-201702，纯度≥98.0%）、大黄素（批号110756-201520，纯度≥98.7%）、大黄素甲醚（批号110758-201415，纯度≥99.1%）、大黄酸（批号110757-200206，纯度100%），均购自成都普瑞法科技开发有限公司。

1.1.3 菌种与培养基 软腐欧文氏菌（编号BNCC166445）和野油菜黄单胞菌（编号BNCC188197）购自北纳创联生物技术有限公司，大肠杆菌（ATCC25312）和金黄色葡萄球菌（ATCC29213）购自中国微生物菌种保藏中心，琼脂（BR 级）购自北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白胨（BR 级）购自上海赛颇生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 唐古特大黄不同溶剂的提取和供试液的配置 精密称取唐古特大黄粗粉50 g，按料液比1∶10 分别加入超纯水、无水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇等4种提取溶剂，经过浸泡2 h、冷凝回流2 h、提取两次后，收集两次滤液，浓缩后冷冻干燥，研磨得到提取物粉末。唐古特大黄粗粉同样按照料液比1∶10的比例加入丙酮并冷浸36 h 后离心、抽滤，将滤液旋转蒸发浓缩并冷冻干燥得到丙酮提取液的冻干粉。丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、乙醇和水提取分别标记为S1～S5。使用时精密称取唐古特大黄提取物粉末，用甲醇配制成0.02 g/mL的溶液后过0.22 μm微孔滤膜，供HPLC分析测试用。精密称量并用少量DMSO（≤5%）溶解后，用水定容至浓度为1 g/mL并过0.22 μm微孔滤膜，超声10 min后供抗菌实验用。配置相同浓度的多菌灵作为对照组。

1.2.2 对照品溶液制备 精密称定适量没食子酸、儿茶素、番泻苷A、番泻苷B、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品，加甲醇分别制成质量浓度分别为0.015 82，0.010 43，0.015 1，0.010 7，0.005 3，0.005 2，0.006 0，0.005 8，0.002 3 g/mL的溶液作为母液，将母液稀释250倍作为A组供试液，稀释180倍作为B组供试液，稀释90倍作为C组供试液备用。

1.2.3 指纹图谱建立 Agilent HC-C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，10%～20%A；10～30 min，20%～35%A；30～40 min，35%～40%A；40～50 min，40%～48%A；50～70 min，48%～55%A；70～80 min，55%～60%A；0～95 min，60%～90%A；95～100 min，90%～10%A；100～110 min，10%A）；流速0.7 mL/min；柱温35 ℃；检测波长280 nm；进样量10 μL。取没食子酸对照品溶液，分别在“2.3.1”项下的色谱条件进样两次，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD小于3.0%，表明该仪器精密性良好。将唐古特大黄水提药液母液在“2.3.1”项色谱条件下，分别于0，2，6，12，24 h 进样，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD 小于3.0%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。精密称取没食子酸粉末2份，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

1.2.4 指纹图谱的相似度评价 将制备好的唐古特大黄的水、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇的5 个供试品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下进样，记录唐古特大黄在110 min 内的色谱图。在中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）版进行数据处理。将唐古特大黄的峰面积数据进行标准化处理，并进行主成分分析和聚类分析。

1.2.5 抗菌活性的检测 将胡萝卜欧文氏菌、野油菜黄单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行复苏、活化、继代培养后，用LB 液体培养基稀释成菌液浓度为1×108CFU/mL 的待接种菌液。用移液枪吸取100 μL 的“2.4.1”项下的菌悬液，加入至LB 平板培养基上，用无菌棉签将菌液涂布均匀，用无菌打孔器在平板的中央打出一个孔，以平板厚度为准加入药液体积约100 μL，平行做3 组。将平板放置于冰箱4～8 h，使药物完全扩散，放入37 ℃恒温培养箱中培养12 h 后，测抑菌圈大小，计算每一提取物抑菌圈的平均值。

1.2.6 关联度分析 灰色关联分析法（grey relation analysis，GRA）是一种包含多因素统计分析的分析方法，是用灰色关联度（grey relational grade，GRG）来描述两个数据间关联强弱的程度[27]。以各供试样品的抑菌圈为参考序列，各峰面积为比较序列，采用灰色关联分析法，将峰面积数值与各供试样品的抑菌圈数值标准化（本研究采用均值化），再求得绝对差序列、关联系数和关联度，最终确定关联度，筛选潜在抗菌活性成分。

2 结果与分析

2.1 唐古特大黄不同溶剂提取物的指纹图谱

在色谱条件相同的情况下，将唐古特大黄色谱图与对照图谱进行比对，能够得出：1.没食子酸，2.儿茶素，11.番泻苷，B12.番泻苷，A19.芦荟大黄素，20.大黄酚，21.大黄素甲醚等，唐古特大黄的蒽醌成分主要包括19 号峰的芦荟大黄素、20 号峰的大黄酚和21 号峰的大黄素甲醚4 种。将5 种溶剂的唐古特大黄提取物的数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件中，以唐古特大黄正丁醇提取物作为对照组，时间窗宽度0.1，采用中位数法，经多点校正、自动匹配共生成共有峰21个，如图1所示。

图1 唐古特大黄5 批样品HPLC 指纹图谱（A）和对照指纹图谱（B）Fig.1 HPLC fingerprints of 5 batches of R.tanguticum Maxim.Ex Balf.（A）and control fingerprint（B）

2.2 相似度分析

从表1可以看出，5种溶剂提取物具有相当高的相似度，均大于0.800，表明这5种提取物具有很好的一致性和稳定性。

表1 唐古特大黄5 种溶剂提取物的相似度Tab.1 Similarity of five solvent extracts of R.tanguticum Maxim.Ex Balf.

2.3 唐古特大黄指纹图谱的聚类分析

根据5 种不同溶剂提取的唐古特大黄提取物的峰面积进行聚类分析，经过归一化处理后，选择Euclidean距离进行聚类分析，结果见图2。可以看出，当Euclidean距离大约为17时，5种溶剂提取的唐古特大黄提取物被分为2类，S1、S3、S2为一类，S4、S5为一类，与相似度分析基本吻合。这表明Euclidean 距离为17时，丙酮、乙酸乙酯、正丁醇所提取的唐古特大黄提取物所含成分类似，乙醇和水提取的唐古特大黄提取物所含成分类似。

图2 唐古特大黄提取物的聚类分析Fig.2 Cluster analysis of R.tanguticum Maxim.Ex Balf.

2.4 主成分分析

根据唐古特大黄5个样品中21个共有特征峰的峰面积，计算其相关系数矩阵，主成分特征值和方差贡献率。从表3 可以看出前3个成分特征值均大于1，且累计贡献率为95.546%，说明这3个主成分对总体的解释率超过80%。图3 显示了各个主成分的重要程度，其中成分1、成分2、成分3 的特征值均大于1，故可以提取前3 个主成分。表4 中的数据表示各主成分和各原始变量的相关系数，此系数越大说明该成分越能代表原始指标变量。可以看出，第一主成分与峰2～峰4、峰6～峰18 的关系是3 个主成分中较大的，说明它对这几个原始变量的解释量多，第二主成分对峰1、5、19、20、21的关系是3个主成分中较大的，说明它对峰19、20、21 的原始变量的解释量多。

图3 成分三维折线图Fig.3 3D line chart of components

表3 主成分初始特征值和贡献率Tab.3 Initial eigenvalues and contribution rates of principal components

表4 初始因子载荷矩阵Tab.4 Initial factor loading matrix

2.5 不同溶剂提取唐古特大黄的抑菌效果评价

抑菌圈的测试结果表明，唐古特大黄的5批样品对胡萝卜欧文氏菌、野油菜黄单胞菌、金黄色葡萄球菌3 种菌均有较强的抑制效果，而对大肠杆菌的抑菌效果较低。其中，5 种提取物对野油菜黄单胞菌的抑菌效果均较好，S3、S4的抑菌圈甚至高达30 mm 以上；对胡萝卜欧文氏菌的抑菌效果中，S5的抑菌效果差（21.5 mm），稍高于对照组多菌灵的（23.4 mm，图4）。5种提取物对于金黄色葡萄球菌的作用效果与上述两种菌的一致，都是S3的抑菌效果最好。从表5 可以看出，其他4 种有机溶剂的抑菌效果都大于水溶剂的，这可能是由于唐古特大黄的主要抑菌成分是蒽醌类化合物[28-29]，其在有机溶剂中的溶解度要远大于在水中的，说明溶剂对有效成分的提取影响是比较大的。相比之下，大肠杆菌对唐古特大黄各提取物的敏感程度普遍偏低，S4的抑菌圈大为14.98 mm，S5为11.10 mm，仅高于S2。

表5 唐古特大黄提取物的抑菌圈直径（，n=3）Tab.5 Inhibition zone diameter（cm）of the extract of R.tanguticum Maxim. Ex Balf.（，n=3） mm

表5 唐古特大黄提取物的抑菌圈直径（，n=3）Tab.5 Inhibition zone diameter（cm）of the extract of R.tanguticum Maxim. Ex Balf.（，n=3） mm

**表示差异1%水平显著性。**represents the 1%level significance of the difference.

图4 多菌灵（a）和大黄提取物对胡萝卜欧文氏菌（b～f）及大黄提取物对野油菜黄单胞菌（g～k）的抑菌圈Fig.4 Antibacterial effect of carbendazim（a）and extracts（b-f）on E.carotovora，extracts on X.campestris（g-k）

2.6 关联度分析

将抑菌圈的数值与指纹图谱共有峰峰面积进行关联分析，结果如表6 所示。其中，唐古特大黄共有峰及其对胡萝卜欧文氏菌、野油菜黄单胞菌、金黄色葡萄球菌抗菌作用的贡献关联度大的峰是峰17，其贡献关联度分别为0.850、0.847、0.830。因此，峰17 所代表的化学活性成分是唐古特大黄的主要潜在抗菌活性成分，峰17没有鉴定出具体是何种化学成分，以待后续研究；而对大肠菌作用的贡献关联度大的峰是峰20，其中峰20在对照指纹图谱上已被鉴定，为大黄酚。实际上，大黄酚因其具有很好的抗菌活性而被广泛应用[30-31]。

表6 各峰对抑菌效果的贡献关联度Tab.6 Contribution correlation degree of each peak to the bacteriostatic effect

3 讨论

大黄药材来源复杂，即便是同一品种大黄也会因生长地域、采集时间和加工时间等的不同而引起组成和含量的变化。研究人员通过将指纹图谱的方法对不同产地、不同品种和不同加工方式的唐古特大黄建立更加全面的、系统的唐古特大黄质量标准[18,32-33]。将指纹图谱与药效相结合更有助于建立化学成分与特殊生物活性之间的联系。在前期的抗菌防腐保鲜的药物筛选的结果上，笔者采用不同的提取溶剂对唐古特大黄的中药活性成分及其抗菌功效之间的关系进行了分析。指纹图谱分析表明，不同溶剂对提取的化学成分的影响较大。抗菌活性实验表明，在同一浓度下，药物对胡萝卜欧文氏菌和野油菜黄单胞菌的敏感性都较高，属于高敏。其中，乙酸乙酯提取物的抑菌圈大，这可能与其中的脂溶性抗菌成分有关[34]。中药化学成分十分复杂，并不是全部的化学成分在抑菌过程中都有着重要的作用，因此，需采用一种合适的方法对谱-效关系进行研究，以便得到在药效学中发挥作用的化学成分[35]。灰色关联分析法（grey relation analysis，GRA）是一种包含多因素统计分析的分析方法，是用灰色关联度（grey relational grade，GRG）来描述两个数据间关联强弱的程度，通过分析共有特征峰与抗菌活性的关联度，筛选出潜在的抑制胡萝卜欧文氏菌、野油菜黄单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活性成分，其中，唐古特大黄含有的蒽醌类化合物能够明显抑制多种细菌和真菌的生长，值得进一步开发应用[36]。

虽然我国大黄种植历史已有4 000 多年，种植面积也逐年增加，但是真正用于植源性病原菌防治的还是很少，大多数都是集中于医源性病原菌上。本论文基于植源性病原菌的抗菌谱-效关系的研究有助于建立大黄防治软腐病菌和黑腐病的质量标志物信息，进一步加深对唐古特大黄的生物防控作用的了解。