4 株链霉菌的鉴定及抑菌活性研究

高玉婷，邓 巍，张 发，李飞腾，3，杨晓燕，佘 容*

（1.大理大学东喜玛拉雅研究院，云南大理 671003；2.大理大学农学与生物科学学院，云南大理 671003；3.大理大学公共卫生学院，云南大理 671000）

自1928 年弗莱明发现青霉素以来，人类就开启了抗生素时代，并由此改变了现代医学的进程，使得医生可以治疗足以致命的细菌感染，挽救了无数人的生命，使人类的平均寿命延长到了77 岁〔1-3〕。同时，抗生素在农业生产中也发挥了极大的作用，如防治动植物病害、刺激植物生长〔4〕、作为兽类药物使用等〔5-7〕，甚至有部分放线菌产生的抗生素还可作为农业除草剂使用〔8〕。

由于抗生素在人类医疗、畜牧、农业和水产等方面的广泛使用和耐药基因可在细菌间横向转移的特点，使得许多细菌对现有抗生素产生了不同程度的耐药性〔9〕，抗生素的治疗效果显著降低，耐药菌株甚至超级细菌开始出现〔10〕。《2018 年CHINET中国细菌耐药性监测》中指出，中国临床分离菌对常见抗菌药物的耐药率仍呈增长趋势〔11〕。面对细菌耐药这一世纪难题，人类已意识到问题的严重性，并加强了对抗生素使用的管理，尽量减少或避免使用抗生素〔12〕。另一方面，为解决已经出现的耐药问题，人类也在积极开发新的抗生素或抗生素的替代物〔13-14〕。

放线菌是自然界广泛分布的一类高（G+C）含量、大多数呈革兰氏阳性的单细胞原核微生物，多为腐生好氧、少数为寄生厌氧型〔15〕。它们能够分解有机质，在自然界的物质循环中起重要作用；同时能够产生多种活性物质，如抗生素、免疫调节剂、植物病原真菌抑制剂、酶制剂等〔16〕。截至目前，人类发现的几千种抗生素中，70% 以上由放线菌产生〔17〕。而且越来越多的全基因组测序结果显示，放线菌基因组内包含极为丰富的天然产物生物合成基因簇资源，这预示放线菌仍然是人类抗生素研发的巨大宝库〔18-20〕。本研究从实验室土壤微生物监测工作中发现了4 株对霉菌具有明显抑菌能力的放线菌，故对其进行了分离、鉴定，并开展了抑菌活性研究，以确定其作为抗生素开发资源菌株的可能性。

1 材料

1.1 菌株

1.1.1 受试菌株 从被污染的培养基中发现、自然状态下对霉菌有较强抑制能力的灰黄链霉菌（Streptomyces flavogriseus），经分离纯化后共得到4株菌（DL002、DL003、DL004、DL005），现保存于大理大学东喜玛拉雅研究院种质资源库。

1.1.2 指示菌株 革兰氏阴性菌：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，BNCC337005）、大肠埃希菌（Escherichia coli ，BNCC133264）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris，BNCC340151）、胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora，BNCC138474）；革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，BNCC186335）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus，BNCC102589）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，BNCC109047）；真菌：黑曲霉（Aspergillus niger，BNCC186380）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani，BNCC189975）、白色假丝酵母（Candia albicans，BNCC336485）、新型隐球酵母（Crypto-coccus neoformans，BNCC225501），以上菌株均购自北纳创联生物技术有限公司；另有编号为MM-1 的枝孢属（Cladosporium）霉菌1 株（为本实验室从发现放线菌菌株DL002 的原始平板上分离纯化，经形态和分子生物学鉴定为枝孢属（Cladosporium）霉菌）。所有菌株均保存于大理大学东喜玛拉雅研究院种质资源库。

1.2 培养基改良高氏1 号培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、玉米培养基、YM 培养基、改良马丁培养基、综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基、改良高氏1 号液体培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基，均参照文献〔21〕进行配制。

2 方法

2.1 受试菌株的分离纯化用接种环挑取菌体，以3 区划线法接种于改良高氏1 号培养基中，26 ℃培养4~7 d，连续划线纯化3 次，镜检确认获得纯培养物后甘油管藏法保种。

2.2 受试菌株鉴定

2.2.1 形态鉴定 将获得的各菌株的纯培养物接种于改良高氏1 号培养基上，观察菌落形态特征，并对其进行革兰氏染色，观察菌体形态特征，参照《放线菌快速鉴定与系统分类》进行形态鉴定。

2.2.2 分子生物学鉴定 通过16S rRNA 序列同源性比对和系统发育分析方法进行分子鉴定。具体方法如下：

（1）基因组DNA 提取：用Ezup 柱式细菌基因组DNA 抽提试剂盒提取基因组DNA。

（2）目的序列的PCR 扩增：以细菌16S rRNA基因通用引物27F/1492R 扩增16S rRNA 序列；PCR 扩增反应体系（50 μL）：PCR Buffer（10×）5 μL，MgCl2（25 mmol/μL）5 μL，dNTP（10 mmol）1.5 μL，Taq DNA 聚合酶0.6 μL，上游引物（10 μmol/μL）1.5 μL，下游引物（10 μmol/μL）1.5 μL，DNA 模板2 μL，无菌超纯水33 μL；PCR 扩增反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，54 ℃复性1 min，72 ℃延伸2.5 min，共32 个循环，72 ℃补平延伸10 min。

（3）PCR 产物直接检测及测序：采用琼脂糖凝胶电泳法对PCR 扩增产物进行检测，操作参照文献〔22〕进行，PCR 产物委托生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

（4）DNA 序列同源性比对：将所测得的DNA 序列导入NCBI 网站中用Blast 工具进行同源性比对，下载亲缘关系较近物种（同源性高于97%）的16S rRNA 序列用于系统发育分析以确定所属物种。

（5）系统发育分析：选择亲缘关系较近的链霉菌属物种（29 株）用于系统发育分析，部分16S rRNA 数据集包括1 377 个碱基，其中保守位点1 017 个，变化位点217 个，简约信息位点87 个。将下载好的待分析序列文件导入Mafft version 7 软件中生成16S rRNA 多序列比对矩阵，用Bioedit v7.2.3 工具分别对多序列比对矩阵进行手动调整以提高其准确度，用Jmodeltest v2.1.10 软件对序列矩阵的最佳核酸替代模型进行选择；在IQ-Tree v1.6.5软件中用最大似然法（maximum likelihood method，ML）对系统发育树进行构建；最后用FigTree v1.3.1、Word 和Photoshop 软件对上一步生成的系统发育树进行后期加工和美化。

2.3 受试菌株抑菌活性测定

2.3.1 丝状真菌指示菌株的抑菌活性测定 在综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板中同时接入受试菌株和立枯丝核菌（R.solani），接种位点相距2.5 cm；在马丁培养基中同时接入受试菌株和黑曲霉（A.niger），接种位点相距2.5 cm，26 ℃培养，每天观察菌株生长情况2 次，记录实验结果，实验结果以3 次重复的平均值表示。

2.3.2 单细胞真菌指示菌株的抑菌活性测定 受试菌株种子液制备：勾取受试菌株菌体，接入改良高氏1 号液体培养基中，28 ℃、160 r/min 摇床培养4 d，备用。

白色假丝酵母（C.albicans）种子液制备：勾取菌体接入改良马丁液体培养基中，35 ℃、160 r/min摇床培养24 h 后，用无菌改良马丁液体培养基稀释至1.5 麦氏比浊度，备用。

新型隐球酵母（C.neoformans）种子液制备：使用YM 液体培养基，制备方法与白色假丝酵母种子液相同。

抑菌活性测定：将无菌滤纸片（φ=8 mm）浸泡至受试菌株种子液中培养24 h 后备用；吸取受试菌株稀释液200 μL 至牛肉膏蛋白胨培养基平板，涂布，再将浸有受试菌株种子液的滤纸片贴至其上，每个平板贴3 片，相距2.5 cm。28 ℃恒温培养，每隔8 h 观察抑菌圈并测定其大小，实验结果以3 次重复的平均值表示。

2.3.3 细菌指示菌株的抑菌活性测定 受试菌株种子液制备：按“2.3.2”项下方法制备。

细菌指示菌株种子液制备：使用牛肉膏蛋白胨液体培养基，制备方法与“2.3.2”项下白色假丝酵母种子液相同。

抑菌活性测定：按“2.3.2”项下方法测定。

3 结果

3.1 受试菌株鉴定结果形态鉴定结果：测试的4株放线菌菌株（DL002、DL003、DL004、DL005）均为革兰氏阳性菌；在改良高氏1 号培养基中形成的菌落形态均不规则，表面干燥粗糙；生长12 周后逐渐变为灰色。

分子生物学鉴定结果：成功获得4 株待测菌株16S rRNA 部分序列，上传至GenBank 数据库（序列号 分 别 为 DL002：MZ216706；DL003：MZ216707；DL004：MZ216708；DL005：MZ216709），4 株待测菌与黄灰链霉菌相似度都达到99%，系统发育分析显示这4 株菌与灰黄链霉菌聚为1 支（自举检测支持度为88%），确定其为该种属菌株。见图1。

图1 链霉菌属系统发育树

3.2 受试菌株抑菌活性筛查结果

3.2.1 对真菌的抑菌活性 受试菌株DL002 对新型隐球酵母有抑菌活性，对白色假丝酵母无抑菌活性，而受试菌株DL003、DL004、DL005 对新型隐球酵母和白色假丝酵母均无抑菌活性。见表1。

表1 受试菌株对单细胞真菌的抑菌效果（抑菌圈直径/菌落直径）

4 株受试菌株对黑曲霉、立枯丝核菌及枝孢属霉菌MM-1 均有明显的抑制作用，且都能抑制黑曲霉产孢。见表2、图2。

图2 菌株对黑曲霉产孢的抑制效果（A）和立枯丝核菌的抑菌效果（B）图

表2 受试菌株对丝状真菌的抑菌效果

测试的4 株菌株与枝孢属霉菌MM-1 在玉米培养基中培养7 d 后均开始出现抑制MM-1 生长的现象，培养至14 d，DL002 对MM-1 的抑制现象最为明显。见图3。

图3 DL002 对枝孢属霉菌MM-1 的抑菌效果图

3.2.2 对细菌的抑菌活性 4 株受试菌株对枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌的生长均有抑制作用；菌株DL002 对普通变形杆菌及枯草芽孢杆菌抑制效果最好，抑菌圈直径达35 mm。4 株菌株对金黄色葡萄球菌均无抑制效果。见表3、图4。

表3 受试菌株对细菌的抑菌效果（抑菌圈直径/菌落直径）

图4 菌株对部分细菌的抑制效果图

4 讨论

本研究分离得到的4 株放线菌菌株DL002、DL003、DL004、DL005 均为黄灰链霉菌。经抑菌活性检测确认，4 株菌对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均具有广泛的抗菌活性，对黑曲霉的产孢均有抑制作用。其中，菌株DL002 对黑曲霉的产孢抑制作用最强。部分黑曲霉会侵染农作物及水果〔23-25〕，病害严重时会导致农作物显著减产，甚至绝收〔26〕。同时，菌株DL002 对普通变形杆菌的抑制作用非常显著，普通变形杆菌在夏秋季节引起食物中毒的能力仅次于沙门氏菌（salmonella）〔27〕，因此，DL002 号菌株可以作为开发新型抑菌药物的优选菌株。

链霉菌是目前放线菌中产生抗生素等活性物质种类最多的菌种，至今各国研究者仍在不断地从链霉菌属中筛选新的天然生物活性物质〔28〕。研究表明，大多数的链霉菌都具有酶活性、抗菌活性及广谱抗菌性〔29〕，对细菌性病原菌金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉均能表现出明显的抑制效果〔30-31〕。但本实验中分离得到的4 株黄灰链霉菌均对金黄色葡萄球菌无抑制活性，且4 株菌株对同一种病原菌的抑制活性存在较大差异，说明同种不同株的黄灰链霉菌菌株之间抗菌性能差异较大。这可能是菌株生境不同导致，也可能是在相同环境中不同菌株间生理性状不同而产生的基因或代谢水平上的表达差异所致〔32-33〕。基于此，对于黄灰链霉菌的研究一方面需加大对不同生境来源菌株的抑菌活性物质筛选，另一方面也可借助全基因组测序研究，全面分析黄灰链霉菌潜在的抗生素相关基因，以充分挖掘黄灰链霉菌的抗生素开发潜能。

致谢：感谢大理大学东喜玛拉雅研究院杨旭教授、肖文研究员在本研究过程中提供的指导和帮助。感谢大理大学三江并流区域生物多样性保护与利用云南省创新团队、中国三江并流区域生物多样性协同创新中心、大理大学云岭滇金丝猴野外科学观测研究站对本研究的支持。