运动通过AMPK信号通路调节糖尿病心肌病的研究进展

摘 要：糖尿病心肌病作为糖尿病患者死亡的主要并发症之一，目前在其治疗上主要分为药物治疗、基因处理和运动干预三种方式，其中运动干预成本低无副作用，应用较为广泛。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的激活主要依赖于运动，大量研究证实了通过激活腺苷酸活化蛋白激酶来改善糖尿病心脏功能受损是具有实际意义的，通过研究运动干预对心肌糖脂代谢和线粒体功能的影响，以此探讨腺苷酸活化蛋白激酶及其下游通路在糖尿病心肌病运动方面的作用，可为糖尿病心肌病的预防和治疗提供重要参考。

关键词：AMPKα2；糖尿病心肌病；运动干预

一、研究对象与研究方法

（一）研究对象与分组

8周龄转基因小鼠及AMPKα2 KO小鼠各28只，分为WT组（基因正常对照组）和KO组（基因敲除组），再次将其随机细分为WT+DS（高脂饮食基因正常组）、WT+DE 组（基因正常运动干预组）和KO+DS（高脂饮食基因敲除组）、KO+DE（运动干预基因敲除组）。各组小鼠分笼饲养，每组分为7笼，每笼4只，小组无干涉进食、饮水，温度恒温20度，湿度百分之50，保持照明及通风。

（二）运动方案

本项目的运动方案采取有氧抗组运动，在实验建模开始前对所有小鼠进行为期3day的运动性适应周期，采取每周三天中间间隔一天的有氧运动干预，每次分为20分钟和60分钟；采取每周三天中间间隔一天的抗阻运动干预，采取垂直爬梯运动，无负重，频率为每组4次，合计4组共16次。

（三）研究方法

1.随机血糖测试

试验周期过半时对小鼠进行随机血糖测试。通过尾尖取血，利用血糖测试仪器及试纸测定小鼠随机血糖值，剔除不符合要求的小鼠。

2.葡萄糖耐量实验

试验周期最后一周对小鼠进行葡萄糖耐量实验。首先对小鼠进行禁食12小时，对其腹腔注射葡萄糖溶液，注射后规定时间周期内分别进行尾尖取血。通过血糖测试仪器测定小鼠血糖值，绘制变化曲线。

3.心脏彩超检查

对小鼠进行麻醉后对其胸前区脱毛，使其仰卧并用设置好的频率对其进行彩超检查。测定左房室瓣血流频谱并进行心尖切面，采集其动态图像，获取LVEDd及LVESd，据此测算其EF，通过二尖瓣舒张早期峰值血流速度和舒张晚期峰值血流速度确定比值。

4.血脂四项检测

首先准备试剂预备仪器，其次进行血清制备。在试验周期结束后，对大鼠进行称重并注射浓度为百分之十的水合三氯乙醛麻醉剂进行麻醉，麻醉后将小鼠仰卧解剖台，腹部脱毛处理。用乙醇对其消毒后从腹部中线剪开进行动脉取血。取得的血样存入PE容器，冷藏30分钟后进行离心处理，离心后取上层血清置于冰箱冷藏以备测试。通过对甘油三脂和总胆固醇进行测定，该项测定可采用专用试纸测定；进行低密度脂蛋白和高密度脂蛋白进行测定，可采用专用试纸测定。

5.取材

配置浓度为10%的水合三氯乙醛，准备取材使用的相关器材，对小鼠进行心脏彩超检查后对其进行乙醚麻醉后心脏取血后取材。首先采用手术剪和手术捏取出小鼠心脏，将其放置于提前生理盐水浸湿的纱布上，然后将心脏上的血液吸取干净后取下三分之一左心室放置于浓度为4%的聚蚁醛进行固定进行WGA染色，放置于冰箱冷藏；将剩余的部分左心室低温冷冻。用手术剪剪开小鼠下肢并将其胫骨与周围及肌肉剥离，去除胫骨后置于浓度为4%的聚蚁醛进行固定并放置于冰箱冷藏，对小鼠的胫骨长度进行测量，将其数值带入计算小鼠心脏重量与胫骨的比值。

6.天狼腥红染色和WGA染色

首先准备相关试剂和仪器。其次是制备石蜡切片。石蜡切片的制备分为制备石蜡标本（固定、组织处理、水洗、脱水、透明和包埋七个步骤）、制片（切片、展片、烤片等三个步骤）、天狼猩红染色和麦胚凝集素染色。

7.蛋白质印迹法

蛋白质印迹法需要制备凝胶，将凝胶梳齿去掉，在预定孔中加入预染蛋白，依次将在将样本分别加入凝胶孔中进行电泳。采用湿式转膜法进行转膜，转膜后用Tris-HCl缓冲盐溶液洗膜，将聚偏氟乙烯膜置于浓度为5%的脱脂牛奶中室温放置2小时。然后再次用Tris-HCl缓冲盐溶液洗膜，根据不同蛋白进行一抗孵育。经过Tris-HCl缓冲盐溶液洗膜后室温放置30分钟进行二抗孵育。将 Super ECL 底物发光液的A 液和 B  液按 1：1 比例混合均匀，滴加至膜上进行显色。采用java的图像处理软件进行目的蛋白分析。

8.统计学分析

采用 SPSS对数据进行统计分析，统计方法使用方差分析，显著性水平設为 0.05。数据采用均值±标准误（M±SEM）表示。

二、AMPKα2在运动干预影响糖尿病心肌病中的作用

（一）AMPKα2基因敲除对运动调节糖尿病心肌病小鼠体重和血液指标的影响

现有研究已经证明了运动在对于抑制肥胖，改善高血糖和高血脂等方面的重要作用。本项目研究通过对大鼠进行运动干预后发现基因正常组的小鼠体重相对于基因敲除组的小鼠下降要更快，在实验后期阶段基因正常运动干预组以及运动干预基因敲除组的体重开始趋于稳定，由此可见AMPKα2在小鼠运动中对减轻体重有重要的作用。虽然说运动干预基因敲除组小鼠与基因正常运动干预组小鼠在糖耐量方面差异较小，但是运动干预基因敲除组小鼠的总胆固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白胆固醇是明显要高于基因正常运动干预组的，血清高密度脂蛋白运输到肝脏的胆固醇要低于基因正常运动干预组。由此可以推测出运动对改善糖尿病心肌病高血脂有一定的作用，结合以往的学者研究可以看出AMPKα2运动在调节心肌糖脂代谢中起重要作用。

（二）AMPKα2基因敲除对运动调节糖尿病心肌病小鼠结构和功能的影响

现有研究证明，长期坚持运动，特别是适量的运动可以引起运动性心肌肥厚，可以人体的心脏起到一定的保护作用，同时也可以改善心肌方面的一些问题。通过本项目研究结果可以看出，在经过阶段性的运动干预后，虽然说各组糖尿病心肌病小鼠在心脏重量、心肌细胞大小和心肌纤维化程度上变化不大，但是通过对其细胞形态以及血管周围纤维化面积发现有一定的下降趋势；除此之外运动后的基因正常小鼠以及基因敲除小鼠的心肌舒张和收缩功能得到一定程度的强化，可见运动干预可以在一定程度上对糖尿病心肌病有一定的改善作用。本项研究还发现了，虽然说运动干预基因敲除组小鼠的心肌收缩功能各指标与基因正常运动干预组基本相似，但是其二尖瓣舒张早期E峰与二尖瓣舒张晚期A峰比值要明显低于基因正常运动干预组，由此可见AMPKα2基因敲除对运动改善糖尿病心肌病有一定的抑制作用。

（三）AMPKα2基因敲除對运动调节糖尿病心肌病小鼠心肌腺苷酸活化蛋白激酶和乙酰辅酶A的影响

运动对心肌、骨骼肌、肝脏和脂肪等外周组织的腺苷酸活化蛋白激酶以及乙酰辅酶A的磷酸化有一定的改善作用，同时对于糖脂代谢紊乱也有一定的改善作用，这点在本项研究中再次予以证实。通过本项研究的结果可以发现，在对小鼠进行运动干预后，各组小鼠的蛋白表达均得到一定程度的上升，可以看出运动是对糖尿病心肌病小鼠心肌腺苷酸活化蛋白激酶活性有一定的促进作用的，同时可以抑制乙酰辅酶A的增加来达到改善心肌脂质代谢紊乱的效果。除此之外，通过本项研究可以看出，AMPKα2基因敲除后，磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α与心肌腺苷酸活化蛋白激酶的比值呈现上升趋势，由此可以推断出运动对激活腺苷酸活化蛋白激酶α1有促进作用，这也是高脂饮食基因敲除组磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α要高于高脂饮食基因敲除组的重要因素。AMPKα2 基因敲除后，高脂饮食基因敲除组和运动干预基因敲除组的心肌磷酸化乙酰辅酶A表达减少，说明运动具备抑制乙酰辅酶A活性的作用，可有效改善心肌脂质代谢紊乱。

（四）AMPKα2基因敲除对运动调节糖尿病心肌病小鼠心肌代谢的影响

首先是对改善糖代谢紊乱的影响方面。通过本项目研究结果可以看到，在运动干预后，基因正常小鼠和基因敲除小鼠的心肌的转运载体-4表达均有所提升，由此可见运动对高脂饮食诱导的小鼠心肌的转运载体-4有一定的改善作用。运动对160千道尔顿大小的底物蛋白的磷酸化水平也不依赖于AMPKα2，可见AMPKα2并非是运动对160千道尔顿大小的底物蛋白以及转运载体-4对葡萄糖的促进作用所必需的。在运动干预后基因正常小鼠的磷酸化糖原合成酶激酶-3增加明显，可以看出持之以恒的运动对高脂饮食诱导的糖尿病心肌病小鼠心肌磷酸化糖原合成酶激酶-3的活性增加，进一步改善心肌糖原合成紊乱。在没有运动干预时，虽然AMPKα2基因敲除对小鼠的磷酸化糖原合成酶激酶-3的表达并没有产生直接影响，但是在运动干预后，AMPKα2基因敲除会导致糖尿病心肌病小鼠心肌磷酸化糖原合成酶激酶-3变化较小。由此可以得出结论，运动是通过AMPKα2来调节糖尿病心肌病小鼠心肌磷酸化糖原合成酶激酶-3的表达，来达到改善心肌糖原合成的目的。

其次是对改善小鼠心肌脂质代谢的影响。现有研究已经证实了运动在脂质代谢，减缓肥胖或糖尿病机体能量代谢紊乱等方面发挥着重要的作用。本项研究结果发现运动调节糖尿病心肌病心肌脂肪酸转位酶的表达依赖于AMPKα2，但是运动在中链酰基辅酶A脱氢酶以及肉碱棕榈酰转移酶1的表达上可能并非只有唯一途径，具体还存在那些途径，需要后期做进一步的研究。

第三是对改善小鼠线粒体功能障碍的影响。研究证实了运动干预后基因正常小鼠和基因敲除小鼠的NAD-依赖性去乙酰化酶Sirtuin-1增长较快，可以推断出持之以恒的运动对改善高脂饮食诱导的糖尿病心肌病小鼠心肌NAD-依赖性去乙酰化酶Sirtuin-1活性降低的问题，进而对心肌线粒体功能障碍得到一定的改善。本研究同时证明了过氧化物酶体增殖物激活受体以及雌激素相关受体α可以通过线粒体融合蛋白Mfn2来对线粒体的功能进行调节。在一个阶段的运动干预后，基因正常小鼠和基因敲除小鼠的过氧化物酶体增殖剂激活受体α在一定程度上表现出降低趋势。由此可见，持之以恒的运动干预对于高脂饮食诱导的糖尿病心肌病小鼠心肌过氧化物酶体增殖剂激活受体α增加，可改善心肌脂质代谢紊乱。

参考文献：

[1]田阁，徐昕，李国平.运动通过AMPK信号通路改善高脂诱导的Ⅱ型糖尿病小鼠心肌糖脂代谢[J].体育科学，2018，38（01）：49-54+78.

[2]肖晗，朴成实，陈瑞飞，张幼怡.AMPK激活通过负性调控C/EBPβ抑制小鼠心脏成纤维细胞TGFβ1表达[J].生理学报，2017，69（02）：123-128.

[3]齐洁，任彩玲，傅建，张钧.运动降低MG53表达及其在缓解高脂膳食大鼠IR中的作用[J].中国运动医学杂志，2016，35（03）：240-247.

作者简介：郑勇（1982—），男，硕士，河南周口人，现为郑州职业技术学院副教授，研究方向体育教育学。

项目来源：河南省高等学校重点科研项目，项目编号20A890017，名称：AMPKα2基因在糖尿病心肌病运动干预研究。