异养硝化-好氧反硝化复合菌剂的固定化与脱氮性能研究1

孙巍，夏春雨，李长秀，林美琴，韦明肯

(广东石油化工学院 生物与食品工程学院，广东 茂名 525000)

固定化菌剂包埋法中，仅依靠海藻酸钠与聚乙烯醇固定菌剂，会存在固定化小球稳定性差、漏菌等缺陷，这就需要交联剂进一步强化固定化小球，然而交联剂的配比在一定程度上又会影响固定化小球的成球效果和菌的活性。本研究从改进菌剂的固定化材料出发，增加适量的活性炭，增强固定化小球的机械强度，采用响应面法优化包埋载体和交联剂的配比，确定固定化菌剂保存活性的合适配比，并验证固定化好氧反硝化菌剂与异养硝化菌剂的脱氮性能。

1 实验材料与方法

1.1 菌种来源

ParacoccusversutusLJ2(GDMCC NO：60338)，PseudomonasmendocinaYG8 (GDMCC NO：60340)，PseudomonasindoloxydansLJ9(GDMCC NO：60339)，以下分别简称为LJ2，YG8，LJ9，这三株异养硝化-好氧反硝化菌均为本实验室分离、纯化、鉴定和专利保藏的菌种，具有优良的异养硝化与好氧反硝化脱氮性能。

1.2 药品、菌剂及培养基配方

海藻酸钠、聚乙烯醇(型号1788)、硼酸、氯化钙，均购自天津大茂，500 g/瓶，分析纯。异养硝化菌剂复配比为m(LJ2)∶m(YG8)∶m(LJ9)=2.6∶1.1∶1.3；好氧反硝化菌剂复配比为m(LJ2)∶m(YG8)∶m(LJ9)=1.5∶1.5∶2；LB液体培养基：酵母浸膏 5 g/L，NaCl 10 g/L，细菌学蛋白胨 10 g/L，pH 7.0；异养硝化培养基：(NH4)2SO40.47 g/L，(CH2COONa)2·6H2O 4.5 g/L，维氏盐溶液50 mL/L，pH 7.0；好氧反硝化培养基[6]：KNO30.72 g/L，(CH2COONa)2·6H2O 4.5 g/L，维氏盐溶液50 mL，pH 7.0；维氏盐溶液：K2HPO46.54 g/L，MgSO4·7H2O 2.5 g/L，NaCl 2.5 g/L，MnSO4·H2O 0.04 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L。培养基所用药品厂家与规格：酵母浸膏、细菌学蛋白胨购自北京陆桥，500 g/瓶。

1.3 菌剂的种子液制备

将LJ9、YG8、LJ2分别接种到LB培养基中进行活化，活化条件为30 ℃、150 r/min，24 h后将活化的菌悬液置于冷冻离心机里，4000 r/min离心10 min。离心后分层的菌悬液去除上层澄清液体，下层菌体用无菌水洗涤，重复以上步骤2～3次，最后将菌悬液的OD600用无菌水调至0.6～0.8后，即可作为LJ9、YG8、LJ2的种子液。

1.4 固定化小球的制备

1)固定化小球的制备。在水浴锅中，水料比9∶1，95 ℃下溶解海藻酸钠和聚乙烯醇，制成海藻酸钠和聚乙烯醇溶液。将活性炭先与一定量的复合菌剂混合并静置20 min，然后将海藻酸钠和聚乙烯醇溶液倒入活性炭与复合菌剂的静置液中；取上述混合溶液，再滴加到氯化钙和硼酸的混合液中，使其成为固定化小球，置于4 ℃冰箱中交联24 h后，取出置于超净工作台上用无菌超纯水洗涤3次，4 ℃下保存于冰箱中备用。

2)固定化小球物理特性评价标准。本研究中包埋载体优化以成球性、稳定性和传质性能这三个因素对固定化小球的物理特性做出评价，每一因素满分为10分，固定化小球物理特性评价标准如表1所示，三者累加即为总分，满分为30分。交联剂优化通过成球性这一因素对其进行评分，总分为10分。

表1 固定化小球物理特性的评价标准

1.5 固定化小球包埋载体响应面优化

固定化小球包埋载体配比优化，以聚乙烯醇(C)、海藻酸钠(B)和活性炭质量分数(A)为优化因素，响应面设计如表2所示。固定化小球物理特性得分为响应值，进行包埋载体的响应面优化实验。

表2 响应面实验因素和水平对照水平因素A/%B/%C/%-11180231013512

1.6 固定化小球交联剂响应面优化

固定化小球以硼酸、氯化钙为交联剂，优化硼酸、氯化钙配比和交联剂体积，响应面设计如表3所示。固定化小球物理特性得分为响应值进行交联剂的响应面优化实验。

表3 响应面实验因素和水平因素对照水平因素Y1(硼酸)/gY2(氯化钙)/gY3(交联剂)/mL-13180042100153120

1.7 固定化异养硝化菌剂脱氮性能研究

1.8 固定化好氧反硝化菌剂脱氮性能研究

2 实验结果与分析

2.1 固定化小球包埋载体组成配比响应面优化

固定化小球包埋载体组成配比应用Design Expert 软件设计，实验结果见表4。回归方程的方差分析及包埋载体配比对固

表4 响应面三个因素配比序号1234567891011121314151617A/%11210121020111012B/%53133333553153113C/%121010101210121010108881010128总得分/分22.026.024.026.021.026.023.027.024.024.024.523.018.022.026.018.025.0

定化效果影响的响应面分析见表5和图1。由表5可知：包埋载体成球性的回归模型F=7.84，P<0.01，表明这个模型的适应性极其显著，用该模型预测包埋载体配比是可靠的。A、B的一次项系数由于P值低于0.05，说明其含量对包埋载体有极显著影响；B和C的二次系数的P值也低于0.01，对包埋载体有极显著影响；此外，A和B的交互作用也对包埋载体产生显著影响。综上所述，该模型能够真实描述活性炭、海藻酸钠和聚乙烯醇之间的相互作用关系，可以用该回归方程模型确定包埋载体组成成分的最佳配比。

表5 回归方程的方差分析

图1 包埋载体配比对固定化效果影响的响应面分析

由表5可知，回归方程存在一个极大值点，在这一点上可以使响应值取得最大值，响应值E为包埋载体固定化成球效果。对表4数据进行多元回归分析，得到下列回归方程式，从而得到包埋载体固定化成球优化配方：活性炭1%，海藻酸钠3%，聚乙烯醇10%。

E=26.2+1.31A+1.31B-1.38AB-BC-0.79A2-2.79B2-2.41C2

2.2 固定化小球交联剂组成配比的响应面优化

固定化小球交联剂组成应用Design Expert 软件设计，实验结果如表6所示。回归方程的方差分析以及

表6 响应面三个因素配比实验序号1234567891011121314151617Y1/g44434434534445535Y2/g22313223231212321Y3/mL10010080100120100808080100120100100120100120100得分/分66596655558676566

交联剂配比对固定化效果影响的响应面分析见表7和图2。根据表7中F=11.01，P<0.01可知，该模型的适应性极其显著，该模型预测交联剂配比是可靠的。Y2的一次项系数P值低于0.01，说明其含量对交联剂有极显著影响；Y1、Y3的一次项系数P值低于0.05，说明其含量对交联剂有显著影响；Y2二次系数的P值也低于0.05，对交联剂有显著影响；此外，Y1和Y2的交互作用也对交联剂产生极显著影响。综上，该模型能够真实描述硼酸、氯化钙和总体积之间的相互作用关系，可以用该回归方程模型确定交联剂组成的最佳配比。

表7 回归方程的方差分析

响应面越陡，等高线的形状越呈椭圆表明两因素之间的交互作用越显著。硼酸与氯化钙之间的交互作用对交联剂固定化成球效果影响如图2a所示。硼酸和氯化钙交互项极显著，在氯化钙含量保持不变的条件下，硼酸含量的增加，包埋载体固定化成球效果下降。交联剂总体积与硼酸之间的交互作用对交联剂固定化成球效果影响如图2b所示。硼酸和交联剂总体积交互项不显著，在硼酸含量保持不变的条件下，交联剂总体积增加，有助于固定化小球的成型。这一点也与已有的研究报道一致。氯化钙与交联剂总体积之间的交互作用对交联剂固定化成球效果影响如图2c所示。氯化钙与交联剂交互项不显著，在交联剂总体积保持一定的条件下，氯化钙含量增加会使包埋载体固定化小球的成球效果下降。

图2 交联剂配比对固定化效果影响的响应面分析

2.3 固定化异养硝化菌剂脱氮性能研究

图3 固定化异养硝化菌剂及其对照组

2.4 固定化好氧反硝化菌剂脱氮研究

图4 好氧反硝化菌剂固定化及其对照组

3 结论与展望

本研究通过响应面法优化混合菌剂的包埋载体最佳配比为聚乙烯醇10%，海藻酸钠3%，活性炭1%；交联剂最佳配比为硼酸3%，氯化钙1%，总体积为100 mL；异养硝化-好氧反硝化菌株(LJ2、YG8、LJ9)混合组成的固定化菌剂的脱氮效果较好且表现稳定。微生物固定化技术大大增强了微生物的生存能力，因此，固定化的菌剂具有较强的抗水流、抗毒害的能力，并且固定化菌剂可重复使用，减少了资源的浪费，较未固定化的游离态菌剂而言更经济实惠，且便于运输及使用，拥有更广阔的市场空间与发展前景。