短小芽孢杆菌KX-33做种衣剂对棉花枯萎病的田间防效

李 赛，高翔宇，苏飞鸿，顾爱星

新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052

棉花枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的一种真菌性土传病害，病原为为尖孢镰刀菌萎蔫专化型真菌 [Fusarium oxysporium Schl.f.sp.vasinfectum（Atk）Snyder&Hanson]，属半知菌亚门镰刀菌属[1]，危害部位为棉花维管束。关于棉花枯萎病的致病机制的研究报道，主要集中在是因为病原菌或寄主植物感病后所产生的毒素致病，还是菌丝体或其产物堵塞导管而导致病株枯萎；有些学者认为,当尖孢镰刀菌从根毛侵入寄主植物后,扩展到导管周围,果胶酶等水解酶、分泌纤维素酶,用来降解寄主植物细胞壁,植物细胞壁被降解以后，细胞内的果胶等物质就会堵塞寄主植物的导管,寄主植物因吸水困难而萎蔫致死，即阻塞学说[2];有些学者认为尖孢镰刀菌侵入寄主植物之后,会分泌一些有毒物质,这些毒素在尖孢镰刀菌致病过程中起着重要作用。目前发现的毒素有镰刀菌酸、恩镰孢毒素、脱氢镰刀菌酸、串珠镰刀菌素、白僵菌素、伏马菌素、麦角固醇、卡毒素以及玉米赤烯酮等。这些有毒物质能损伤寄主植物根系，也会影响种子萌发，吕金殿等证实了病原菌毒素蛋白是棉花致病的关键，即毒素学说[3]。由于枯萎病为土传真菌病害，通过田间喷洒普通化学农药等解决棉花枯萎病危害效果不明显，并加大了对环境的污染[4]。为了响应国家的绿色防治的号召，培育抗病棉花新品种和生物防治是解决这一问题的有效途径。

现阶段的研究中已发现许多对棉花枯萎病菌有抑制作用的拮抗微生物[5][6]，经过大量的试验验证，许多拮抗微生物被开发为生防产品逐步走向实际应用[7]。周京龙[8]等发现蜡状芽孢杆菌YUPP-10菌株能抑制尖镰孢的生长、促进棉花部分生物量指标的增长并控制枯萎病的危害；贾熙超[9]等发现生防菌JNJX-2多粘类芽孢杆菌是通过抑制病原菌丝和孢子发挥作用的，抑菌物质通过菌丝发生溶断、原生质溢出、孢子壁破碎等途径使病原菌无法再侵染宿主植物；丁建朋[9]等研究发现解淀粉芽孢杆菌HFW217对棉花枯萎病的预防和治疗作用显著，温室和田间对棉花枯萎病防治效果分别达到77.62%和73.18%；李玉洋[10]等从土壤中分离出的解淀粉芽孢杆菌SN06，其拮抗作用具有较好的热稳定性、酸碱稳定性与蛋白酶稳定性，接种解淀粉芽孢杆菌SN06可显著降低枯萎病的发病指数,平均防效高达65.19%。

新发展阶段，由于国家对环境污染和生态环境可持续发展战略的重视，农业生产也要遵循绿色、健康、高效的发展理念，生物型种衣剂以其对环境无残留、无污染且安全性好等优点成为棉花病虫害防治的重要发展方向[11]。

本实验将已在室内进行防治效果初步鉴定的生防菌短小芽孢杆菌KX-33为主要成分制作种衣剂，研究其在田间的实际防治效果，为新型微生物种衣剂的制作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试棉种

选用抗病品种：10719；耐病品种：10857；感病品种：10900。

1.1.2 供试种衣剂

羧甲基纤维素钠（沪试）。

1.1.3 供试微生物与药剂

拮抗微生物；由新疆农业大学农学院棉花病害研究室筛选出具有对棉花枯萎病较好拮抗作用的的短小芽孢杆菌KX-33。

病原菌：棉花枯萎病病原菌。

药剂：0.3%四霉素水剂(辽宁微科生物工程股份有限公司)，200亿/g枯草芽孢杆菌微生物菌剂（山东慧可丰生物有限公司），8%宁南霉素水剂（淹溶生物股份有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 拮抗菌菌液制备

挑取纯化的拮抗菌KX-33单菌落，接种至装有100mL牛肉膏蛋白胨培养液的250mL三角瓶中，进行摇菌处理使拮抗菌快速繁殖，将孢子悬液浓度调至1×108CFU/mL备用。

1.2.2 种衣剂的制作

设置菌液与成膜剂用量比例为100∶1，种衣剂成分包括KX-33菌液、成膜剂、LB液体培养基，含KX-33种衣剂现配现用，种衣剂与种子比例为1∶100[12]。

选用有效成分含量为200亿/g枯草芽孢杆菌微生物菌剂与成膜剂按照100∶1混合，制成50mL液体种衣剂，现配现用。成分为成膜剂、去离子水。选用有效成分含量为0.3%四霉素水剂和8%宁南霉素水剂，配制成1g/mL药液，与成膜剂按照100∶1混合，制成50mL液体种衣剂，现配现用[13]。

将各配好种衣剂分别与棉花种子拌种包衣，晾干备用。

1.2.3 田间病原菌接种

利用菌包培养物法进行田间致病菌的接种操作：将病原菌活化培养后，挑取菌饼进行180 r/min、30℃摇菌培养7d，将菌液装入菌包中于以进行消毒杀菌的阴凉仓库内静置培养，待菌包长满菌丝于7月15日棉花现蕾期剖开撒入距棉株根部10cm下的土壤中埋藏，及时浇水以保证菌种活性[14]。

1.2.4 田间防效试验

选取健康饱满的棉种进行脱绒处理，灭菌清洗后晾干[14]。试验设置五组处理：KX-33、枯草芽孢杆菌、宁南霉素与四霉素处理以及无菌水对照，每组处理三次随机重复。每次重复为2.5×2m小区，穴间距为10cm，每穴两粒，出苗后进行定苗间苗操作。田间进行常规管理，病原菌接种后，自接种后20d开始，每隔15d进行一次病情记录，至9月20进行剖秆数据收集，统计总叶数及发病叶数。病情分级标准如下[15]：

表1 病情分级标准

表2 田间病情考察分级标准

病情指数=∑（该级植株数×病害等级）/（调查植株数×最严重等级）×100；

防治效果（%）=[（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数]×100[15]。

1.2.5 农艺性状调查

在8月份末，对棉花的农艺性状展开调查，测量各项生长性状，并记录数据：株高、始节高、果枝数、有效果枝数、铃数、有效铃数；并在田间对每次处理选取连续的10株棉花，室内记录棉花的平均籽棉重、平均皮棉重。

1.2.6 统计分析

采用Excel和SPSS20.0进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 田间防效分析

由表4可知，三种不同抗病品种在个处理下病情指数均显著低于对照。其中抗病品种10719在枯草芽孢杆菌处理下病情指数均为最低，最低为6.58；耐病品种10857在枯草芽孢杆菌处理下病情指数最低，为6.87。三种品种在枯草芽孢杆菌处理下均为最低，KX-33处理下各品种的病情指数与防效均与枯草芽孢杆菌相近。

表3 8月5日病情防效

表4 8月20日病情防效

由4张病情指数表中可知，四种处理的最高防效依次为58.72%、56.49%、62.48%和60.83%。防效从8月5日随时间逐渐下降至9月20日收获期前各个处理的防效分别下降至44.42%、42.92%、47.28%、46.10%，总体防效水平为枯草芽孢杆菌处理＞KX-33处理＞宁南霉素处理＞四霉素处理。就品种水平而言抗病品种10719对微生物种衣剂的敏感程度较高，防效表现明显优于其他两种棉花品种。实验证明KX-33种衣剂处理的防效表现良好，对棉花枯萎病有较强的抑制作用。

表5 9月5日病情防效

表6 9月20日病情防效

2.2 农艺性状分析

四组药剂对棉株的农艺性状具有不同程度的促生效果，对各项农艺性状的增益效果有所差异。株高方面，KX-33处理下的株高较对照组增长尤为明显，增幅为7.81%，最高为66.73 cm；始节高方面，枯草芽孢杆菌处理下较对照组增长尤为明显，增幅为16.16%，最高始节高为18.23cm；果枝数、铃数方面四种处理均略高于对照组且四种处理之间的差异不明显；产量方面，KX-33处理的皮棉与籽棉产量相较于其他处理增产效果显著，相较于对照组增产幅度为19.14%和13.38%。KX-33棉株的促生效果的增益显著，对株高、始节高、皮棉和籽棉产量等方面均有影响。

表7 药剂对棉花农艺性状的影响（10719）

表8 药剂对棉花农艺性状的影响（10765）

表9 药剂对棉花农艺性状的影响（10900）

3 讨论

现阶段在田间的实际生产中，由于价格、购买途径和使用方法等原因，微生物菌剂的市场占比依旧较少，仍以化学药剂为主。

在田间防效实验中，含短小芽孢杆菌KX-33的种衣剂包衣的三个品种，均对棉花枯萎病表现出良好的防治效果，总体防效表现中品种10719的防效表现较优，防效率最高为60.83%，柳自清[13]等的盆栽防效实验中的盆栽防效试验中接种棉花枯萎病第45d时，1×108CFU/mL浓度微生物种衣剂处理下对两个品种棉花的防效均最好，分别为65.35%和63.77%，略高于本实验结果；贾熙超[16]通过盆栽实验发现菌株JNJX-2对棉花枯萎病有一定的防治作用，防效为54.77%，低于本试验结果。本实验中的防效数据略低于柳自清室内防效试验，分析原因可能是田间的发病效果更加严重。

后续实验中可以将拮抗菌与药剂或者微生物菌剂混合进行协同防治效果的研究，继续优化种衣剂配方，为微生物种衣剂的开发提供参考依据。