乳制品等食品中维生素A和E含量测定方法研究进展

范芳芳，邹 力，魏宁果，安 瑜

陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安 710048

0 引言

维生素A（Vitamin A，VA）和E（Vitamin E，VE）是人和动物维持正常的生理功能而必需的微量有机物质，具有促进骨骼生长、维持视力发育、促代谢以及抗衰老的重要作用[1]。维生素A的活性形式包括视黄醇、视黄醛和视黄酸3 种衍生物，其中视黄醇是VA主要的天然存在形式，主要存在于动物体内[2]。VE又称生育酚，目前发现的主要包括α-T，β-T，γ-T，δ-T 4 种生育酚和α-TT，β-TT，γ-TT，δ-TT 4种生育三烯酚[3]。由于VA和VE结构复杂，异构体较多，准确测量比较困难。国内外学者致力于VA和VE的检测研究较多，目前主要有微生物法法、光谱分析法、色谱质谱分析法、加压毛细管电色谱法、电化学分析法等[4]。本文主要综述了电化学分析法、分光光度法、液相色谱（串联质谱）法以及气相色谱（串联质谱）等检测方法的操作过程以及结果研究，对比分析了各种方法优缺点，为提升VA和VE的检测标准提供参考。

1 电化学法

电化学法是利用待测物质在电极表面发生氧化还原反应而引起的电位变化，从而实现对待测物质的定性或定量检测[5]。有研究以甲苯和乙醇的混合溶液为提取溶剂，采用计时电位滴定法，测定了4 种植物油中的VE，该法最低检出限为15 mg/dm3[6]。尹淑涛等[7]采用恒电位聚合的方法，快速检测植物油中的VE，该法相关系数（R2）为0.9963，最低检出限为2×10-6mol/L（S/N＝3）。电化学方法具有灵敏度高、设备成本低、操作简单、易于自动化等优点，适用于食品快检。开发新的电极材料，同时实现VA和VE在乳制品等食品中的快速检测是今后的发展趋势。

2 分光光度法

分光光度法是通过测定目标物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度，对该物质进行定性定量的分析方法，在食品检测领域有着非常重要的应用[8]。李湘玲等[9]采用分光光度法测定维生素E丸中的VE含量，该法测得回收率为99.71%~100.21之间，变异系数为0.24%（n＝5）。刘树恒[10]在表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵的存在下利用VE将Fe3＋还原为Fe2＋，以5-硝基-1，10-菲咯啉为显色剂采用分光光度法间接测定VE，该法相关系数0.9993，VE的含量在0.3~2.0 mg/L范围内，符合比耳定律，该法检测结果与《中国药典》中VE的检测方法所得结果一致。分光光度法与统计学方法（正交法、最小二乘法等）联用，以及分光光度计与其他检测仪器联用，都可以使其应用范围进一步扩大。

3 气相色谱（串联质谱）法

在液相色谱技术发展起来以前，脂溶性维生素多采用气相色谱（串联质谱）法进行分析检测。气相色谱（串联质谱）法是以气体为流动相的色层分离分析方法，该法在乳制品等食品中VA和VE的检测应用如表1。

表1 气相色谱（串联质谱）法在食品中VA和VE的检测应用

气相色谱法测定VE所用色谱柱从填充柱到毛细管柱再到表面修饰或者化学改性的色谱柱[15]，具有灵敏度高，干扰小、分离度高、检出限低等优点。由于气相色谱法流动相为气体，升温温度过高，对热不稳定性VA检测结果不准确，虽说气相色谱-三重四极杆质谱法能够解决这一问题，但是仪器设备昂贵，实验室检测不便于普遍推广。

4 液相色谱法

液相色谱法是以液体为流动相的色谱分析方法，基本原理是基于固定相对目标物和杂质的吸附能力不同而分离，并定量检测。我国的国标方法和国际欧盟的方法均采用液相色谱法，因此该法是乳制品等食品中VA和VE检测的主流方法，也是被各位学者研究最多的方法之一。液相色谱法又分为反相液相色谱和正向液相色谱。

4.1 反向液相色谱

反向液相色谱在乳制品中VA和VE的检测应用主要是以GB5009.82—2016[16]第一法为代表，包括皂化、液液提取、洗涤、浓缩等步骤。该法操作步骤繁琐、使用有机试剂较多、重现性较差，我国学者在此基础上，对各个步骤的条件优化研究较多。邹力等[17]优化了国标方法，提出实验操作注意事项，该法VA和VE的回收率分别为92.95%和90.66%，相对偏差分别为1.98%和1.48%，且重现性较好。本文从是否皂化、提取方式、提取溶剂以及应用范围等方面对我国近年来反向液相色谱在乳制品等食品中VA和VE的检测应用进行研究（表2）。由上表可知：

（1）乳制品等食品中VA和VE的提取溶剂有石油醚、乙醚、正己烷、甲醇、乙醇等有机试剂，这些溶剂的提取效果基本都能满足要求。

（2）乳制品等食品中脂溶性维生素会被蛋白质、脂肪等有机大分子会以各种形式包裹在食品颗粒中，需要水解皂化，释放出来，但保健食品基质简单，组分单一，无需皂化，直接提取，即可得到较好的分离效果。Turner等[32]等研究用酶解样品的形式代替皂化过程，使维生素和脂肪达到分离的目的。

（3）液液提取容易产生乳化，这是实验重复性差的主要影响因素之一。在线固相萃取技术克服了这一问题，又减少了人工操作，易于实现自动化。

（4）高效液相双波长检测以及多波长荧光检测器的联用为同时测定VA和VE提供了设备保障，减少了分析时间。

（5）在线二维色谱（正向色谱和反相色谱联用）技术为同时测定VA、VE和VD的含量提供了新思路，缩短了分析时间，适用于批量化处理，但是表2涉及文献的VA和VE测定均为二维色谱中的反向色谱。

表2 反向液相色谱在乳制品等食品中VA和VE的检测应用

（6）反向色谱技术具有平衡时间短、使用有机试剂种类少等优点，但是无法实现VA和VE的8 种异构体完全分离的目的。

4.2 正向液相色谱

正向液相色谱在乳制品等食品中脂溶性维生素的检测应用主要是以GB5009.82—2016[16]第二法为代表的VE检测方法，该法不经过皂化，液液提取后浓缩进样。相对于反向高效液相色谱来讲，具有操作简单、重现性好、能够分离VE的8 种异构体的优点，该法的研究进展如表3。由上表可以看出：

表3 正向液相色谱在乳制品等食品中VA和VE的检测应用

（1）该法的提取溶剂主要为己烷、醚类等极性有机溶剂。

（2）样品非经皂化，液液萃取法直接提取即可分离出目标物。

（3）正向高效液相色谱法在乳制品等食品中VE的分析检测中优势较为明显。但由于正向高效液相色谱存在平衡时间长，有机溶剂使用种类多量大等缺点[36]，在检测实验室的应用并不普及。

5 高效液相串联质谱法

高效液相色谱串联质谱法是一种集高效分离、多组分定性、定量于一体的分析方法，尤其对热不稳定性化合物的分离和鉴定具有独特优势。高效液相串联质谱法在乳制品等食品中VA和VE的检测应用如表4。

由表4可以看出，高效液相色谱串联质谱法对样品前处理中提取溶剂、提取方式以及是否皂化等因素并无特殊要求，样品前处理净化方式除了液液提取，固相萃取外，也可使用凝胶色谱法。该法基质干扰小、并且能够同时检测大部分的VA和VE异构体，但是仪器设备贵，需要加内标，成本较高，食品检测实验室很难达到全面普及。

表4 高效液相串联质谱法在乳制品等食品中VA和VE的检测应用

6 超高效合相色谱法

超高效合相色谱法（Ultra PerformanceConvergence Chromatography，UPC2） 是近年来结合了液相色谱和气相色谱技术而发展起来的一种分析方法。以超临界流体CO2为流动相主体，将气相色谱和液相色谱优势完美结合，为结构极其相似的手性化合物的拆分提供可能。周围等[42]采用异丙醇-正己烷（1:1，V/V）溶液提取复合维生素片中11 种脂溶性维生素（VA、VE、VD、VK）及其衍生物，并与超高效合相色谱（UPC2）技术联用，达到了很好的分离效果，该法加标回收率范围为97.31% ~98.76%，相对标准偏差为0.41%~0.96%，为多种脂溶性维生素在食品中同时检测提供了技术支持。

UPC2法具有环境污染小、灵敏度高、重现性好、准确度高以及运行成本低等优点，并为同时检测乳制品等食品中VA和VE所有异构体提供了新的研究方法。

7 结论

实现前处理的自动化以及多种同分异构体同时检测是乳制品等食品中VA和VE检测的研究趋势和发展方向，但是开发一种重现性好、准确度高并且我国大部分食品检测实验室都能普及的检测方法更具有实际意义，即该检测方法既要做到技术上可行，也要做到经济上合理。本文从前处理是否需要造化、提取方式、提取溶剂、检测仪器、方法适用范围以及检测效果等方面综述了电化学法、分光光度法、气相色谱（串联质谱法）、液相色谱法、液相质谱法、高效液相合相色谱法的研究进展。这为乳制品等食品中VA和VE的前处理和上机分析的进一步条件优化提供参考，为我国食品监管部门实现多方位多层级监管提供技术支撑。