人结肠癌5-氟尿嘧啶耐药细胞株SW620/Fu和LoVo/Fu的构建与鉴定

张 伟，朱壮彦，张海燕，韩丽炘，张建业，周雯敏，闫燕艳,*

（1.大同市第二人民医院（肿瘤医院），山西大同 037005；2.山西大同大学医学院，山西大同 037009；3.广州医科大学药学院，广东省分子靶标与临床药理学重点实验室，广东广州 511436）

结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界处。由于结肠癌的侵袭性高、预后差和缺乏靶向治疗，其发病率在全球中排名第三[1]。由于结肠癌患者的早期症状不明显，只有40%左右的患者能在疾病的早期诊断出来。手术切除仍是II～III期结肠癌患者的最佳治疗选择，也是局部结肠癌患者和远处转移的患者的治疗选择，但30%～50%的患者术后肿瘤复发，且发现与癌症相关死亡风险较高。化疗是晚期结肠癌患者最重要的治疗方法之一，其中以5-Fu 为基础的辅助化疗及姑息化疗应用最为广泛，5-Fu 可通过干扰肿瘤细胞的核酸代谢进而抑制肿瘤细胞的增殖和转移。尽管全身性的药物治疗取得了一定的进展，长期给药5-Fu 引起结肠癌细胞的原发或继发性耐药仍然是化疗成功的主要障碍[2]。目前5-Fu耐药的分子机制尚不明确，因此构建5-Fu耐药体外实验模型对深入研究肿瘤耐药机制具有重要的意义。本研究采用药物逐步递增法诱导稳定的SW620/Fu 和LoVo/Fu 耐药细胞株，对亲本细胞和耐药细胞进行比较，初步探讨其生物学特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

人结肠癌细胞株SW620 和LoVo 购自ATCC公司。

1.1.2 主要试剂

5-Fu 购自Sigma 公司，0.25%胰蛋白酶购自Gibco 公司，F12K 培养基、L15 培养基、PBS 缓冲液、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液及Formazan 溶液购自iCell公司，MTT购自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人结肠癌细胞SW620 和LoVo 分别在含10%胎牛血清的L15 培养基和F12K 培养基中培养，在37 ℃、5%CO2恒温培养箱孵育，根据细胞状态和密度更换培养液或传代。SW620 细胞培养使用密封培养瓶，LoVo 细胞培养使用透气培养瓶。待细胞汇合度达到85%以上时，0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 MTT法检测亲本细胞的IC50值

取对数期生长的人结肠癌细胞消化处理后，按1×104/孔将细胞接种于96 孔细胞培养板，每组设6 个复孔。置于37 ℃，5%CO2培养箱培养至细胞贴壁后，将培养基更换为含不同浓度5-Fu 的完全培养基：6.25，12.5，25，50，100，200，400，800，1 600 μmol/L。每孔200 μL，置于37 ℃，5% CO2培养箱分别培养相应时间后，取出96 孔板，使用排枪将提前配置好的20 μL MTT（5 mg/mL）溶液加入到每个培养孔中，继续培养4 h。4 h后，取出96孔板，吸除培养基，排枪每孔加入150 μL Formazan溶液，置摇床上低速振荡10～30 min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在570 nm处测量各孔的吸光值，分析实验结果。细胞抑制率（%）=（1-实验组平均吸光值/对照组平均吸光值）× 100。

1.2.3 人结肠癌耐药细胞株的建立和鉴定

应用浓度递增法诱导得到耐药细胞株。取对数生长期的SW620和LoVo细胞以10×105/孔接种于T25细胞培养中，置于37 ℃恒温培养箱中培养。待细胞生长稳定，汇合度约80%时，将培养基更换为相应含药完全培养基，SW620 为55 μmol/L，LoVo 为151 μmol/L。置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h 后，更换为不含药物的完全培养基，视细胞死亡速度调整换液频率。细胞生长汇合度达到80%左右，按1∶2的比例传代。待细胞贴壁后，再加入2 倍浓度的5-Fu 的完全培养基刺激细胞24 h，更换为不含药物的完全培养基并换液。药物递增浓度如下：①SW620 细胞为55，110，220，440 μmol/L；②LoVo 细胞为151，302，604 μmol/L。约170 d时，细胞在最大药物浓度可正常生长，汇合度约80%，视为耐药株，并分别命名为SW620/Fu，LoVo/Fu。用Axygen 的基因组抽提试剂盒提取DNA，采用21-STR扩增方案扩增，在ABI 3730XL型遗传分析仪上对STR位点和性别基因Amelogenin进行检测。

1.2.4 MTT法检测耐药细胞的IC50值

采用MTT 法检测5-Fu 对耐药细胞SW620/Fu 和LoVo/Fu 的IC50值，步骤同1.2.2。细胞抑制率（%）=（1-实验组平均吸光值/对照组平均吸光值）× 100。耐药指数（resistance index,RI）=耐药细胞IC50/亲代细胞IC50。

1.3 统计学方法

以上所有试验重复3次，应用Graphpad Prism 7.0软件作图，SPSS 20.0统计学软件统计数据，两组间比较采用t检验，P ＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人结肠癌耐药细胞株SW620/Fu 和LoVo/Fu 的细胞形态学观察和鉴定

SW620 和LoVo 细胞经过递增浓度的5-Fu 作用后，历时约6 月成功在体外构建5-Fu 获得性耐药细胞株SW620/Fu 和LoVo/Fu。倒置显微镜下观察到两种人结肠癌耐药细胞株均贴壁生长，胞质见空泡形成、颗粒增多，具有持续的活性并能稳定增殖。此外，人结肠癌耐药细胞株SW620/Fu 和LoVo/Fu 与短串重复序列（short tandem repeat,STR）分析结果高度匹配。

2.2 5-Fu 对人结肠癌细胞SW620 和SW620/Fu、LoVo和LoVo/Fu的生长抑制作用

根据MTT 实验结果显示，人结肠癌两对细胞的生存率随着5-Fu 浓度的增加而降低（图1）。5-Fu 对SW620和SW620/Fu细胞的IC50值分别为58.17±3.54和443.71 ± 14.27 μmol/L；对LoVo 和LoVo/Fu 细胞的IC50值分别为152.53±13.95 和1049.54±70.51 μmol/L(均P＜0.05)。由耐药指数（RI）=耐药细胞IC50/亲代细胞IC50公式得到SW620/Fu 细胞的耐药指数为7.63，LoVo/Fu细胞的耐药指数为6.88。

图1 5-Fu对人结肠癌细胞的生长抑制作用

3 讨论

结肠癌是一个严重威胁人类健康的公共卫生问题，其发病率和死亡率位于癌症统计的前列。目前常见的治疗包括手术治疗、化疗、放疗和免疫治疗等，然而大多数结肠癌患者仍存在化疗失败和肿瘤复发的风险，可能是由药物抵抗和多药耐药造成的[3]。

5-Fu 是治疗结肠癌的一个基础化疗药物，主要通过影响体内的代谢药物，使其插入DNA 或RNA 中造成细胞损伤，从而达到抗肿瘤的效果。然而，5-Fu耐药的产生常常影响大多数结肠癌患者的化疗效果。在体外和临床研究中，胸腺嘧啶合成酶（thymine synthase,TS）和二氢嘧啶脱氢酶（dihydropyrimidine dehydrogenase,DPYD）的活性增强是肿瘤细胞对5-Fu 耐药的主要机制[4]。此外，5-Fu 耐药还跟DNA 损伤修复异常、细胞周期改变、凋亡缺陷等情况密切相关。对5-Fu耐药相关机制的研究有助于开发新型有效抗癌化疗方案，因此构建耐药癌细胞系、阐明肿瘤耐药机制，是改善5-Fu耐药患者预后的重要途径。

目前，国内外相继建立了乳腺癌、食管鳞癌、胰腺癌等的5-Fu 耐药细胞株模型。Takahashi 等人通过将三阴性乳腺癌细胞反复暴露于逐步增加的5-Fu浓度，建立了5-Fu 耐药细胞系MDA-MB-231/5-Fu，其IC50值是亲代细胞MDA-MB-231 的5.5 倍[5]。Zhang等人通过逐步增加5-Fu浓度建立了5-Fu耐药的食管鳞癌细胞株Eca-109/5-Fu，结果表明耐药相关蛋白、上皮-间充质转化相关蛋白和癌症干细胞相关蛋白在两种细胞株之间表现出显著差异[6]。张厚斌等人采用5-Fu低浓度梯度递增联合大剂量冲击诱导法建立了获得性的Patu8988/5-Fu 多药耐药细胞株，耐药基因MDR1 的表达上调和HIF-1α 介导的凋亡耐受可能是Patu8988/5-Fu 获得性耐药的相关机制[7]。此外，5-Fu 耐药的结直肠癌细胞株亦有报道，如HT-29/5-Fu[8]、SW480/5-Fu[9]、LS174T/5-Fu[10]等，但以SW620 和LoVo 细胞建立5-Fu 耐药细胞株的研究较少。

本研究采用药物逐步递增法诱导方法，历时约6 月，成功建立了稳定的SW620/Fu 和LoVo/Fu 耐药细胞株。耐药细胞株的诱导过程实际上是通过增大药物浓度将大部分对药物敏感的细胞杀死，仅有少数不敏感的肿瘤细胞存活并进行扩增。相对于亲代细胞，显微镜下观察到SW620/Fu 和LoVo/Fu 的形态有不同程度的差异，胞质见空泡形成，颗粒增多。我们证实了耐药细胞和亲代细胞存在某种程度上的差异，但尚未明确在结肠癌中5-Fu 耐药的调控机制。

综上所述，我们通过药物逐步递增法，成功构建了5-Fu 耐药的人结肠癌细胞株SW620/Fu 和LoVo/Fu。建立体外耐药模型对解释复杂的耐药机制、筛选耐药靶标和逆转肿瘤耐药具有十分重要的意义，为今后的临床耐药研究提供一定的参考价值。