黄芩苷通过PI3K-Akt-mTOR通路诱导淋巴瘤细胞凋亡和自噬

雷晓红，高树丽，岳云霄，史存真

1.平顶山市第一人民医院药学部，平顶山 467000；2.平顶山市第一人民医院药学部药剂科，平顶山 467000；3.平顶山市第一人民医院药学部临床药学室，平顶山 467000；4.郑州大学第一附属医院肿瘤科，郑州 450000

恶性淋巴瘤是指发生于淋巴结、具有较高异质性的肿瘤，最为常见的是非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin lymphoma，NHL）。B 细胞淋巴瘤（B cell lymphoma，BCL）病例约占NHL 总病例数的80%［1］。目前，针对BCL的治疗主要是环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松和抗CD20利妥昔单抗靶向药物的综合治疗［2］。

黄芩苷（baicalin，C21H18O11）是从唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensisGeorigi）的干燥根中提取的一种黄酮类化合物，具有抗病毒［3］、抗炎［4］、抗过敏［5］、抗氧化［6］、抗肿瘤［7］的作用以及对免疫系统［8］、神经系统［9］的保护等作用。

PI3K-Akt-m TOR 信号转导通路是细胞内重要的信号转导途径，该信号通路激活可维持细胞存活，是肿瘤细胞抵抗凋亡的重要机制之一［10］。本文探究黄芩苷对淋巴瘤细胞增殖的抑制作用，并基于PI3KAkt-m TOR 信号转导通路考察其作用机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

流式细胞仪（美国Becton，Dickinson and Company公司）；TE77XP 型半干转膜仪系统（美国Hoefer公司）；DYY-1C 型凝胶成像系统（北京六一生物科技有限公司）；荧光显微镜（日本Nikon 公司）；Power Pack HV 型电泳仪（美国Bio-Rad公司）；倒置相差显微镜（德国Leica公司）；Cytopro离心涂片机（美国ELITech Group公司）；低温型高速离心机（美国Beckman Coulter公司）。

1.2 试药

十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfonate，SDS）、三乙醇胺缓冲盐水溶液（tris buffered saline，Tris）（p H 8.8与p H 6.8）、质量浓度300 mg·L－1聚丙烯酰胺、10×电泳液、ECL 发光显影液、50×TAE和TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（编号C1062M）均购自碧云天生物技术有限公司；PARP 抗体、LC3抗体均购自Cell Signaling Technology 公司；Hoechst 33258购自碧云天生物技术有限公司；FITC-Annexin V／PI双染试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；p-PI3K、p-Akt、p-m TOR 抗体（一抗）均购自英国Abcam 公 司；LC3 抗 体（美 国Cell Signaling Technology公司）；标记HRP 的GAPDH 抗体、DC蛋白测定试剂盒和PVDF 膜均购自美国Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶细胞消化液、RIPA 裂解液、PMSF均购自上海碧云天生物技术有限公司；HRP-兔二抗及鼠二抗、Dylight 488-兔二抗均购自美国Earthox Life Sciences公司。

黄芩苷（质量分数≥98%，货号A0016），购自成都曼思特生物科技有限公司，用DMSO 配制成质量浓度为80 g·L－1的储备液，－20℃密闭储存。

1.3 细胞

人Burkitt淋巴瘤细胞系Raji细胞株购自美国ATCC公司，并由平顶山市第一人民医院细胞室传代培养。Raji细胞在含有体积分数10%胎牛血清（Hyclone）和抗生素的RPMI-1640培养基中培养，并置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱中孵育。

2 方法

2.1 CCK-8法检测淋巴瘤细胞活力

将处于对数生长期的淋巴癌Raji细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后分别加入终质量浓度为0、50、100、200、400、800μg·m L－1的黄芩苷处理。将细胞置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱中培养24 h后，用CCK-8试剂盒检测细胞毒性，用酶标仪检测450 nm 处的吸光度。抑制率＝［1－（实验组A值－空白组A值）／（对照组A值－空白组A值）］×100%。

2.2 台盼蓝染色检测淋巴瘤细胞增殖

将密度约为2.0×105个m L－1、处于对数生长期的淋巴瘤Raji细胞悬液均匀加入12孔板中，待细胞贴壁后分别加入终质量浓度为0、100、200、400μg·m L－1的黄芩苷进行孵育处理。分别于孵育8、12、24 h 进行台盼蓝染色，用细胞计数器进行计数，每组细胞平行计数5次，取平均数绘制生长曲线。

2.3 Annexin V-FITC／PI检测细胞凋亡

将密度约为1.5×106个·m L－1、处于对数生长期的淋巴瘤Raji细胞悬液均匀加入6 孔板，置于细胞培养箱中孵育至细胞贴壁，用不同质量浓度的黄芩苷处理。孵育24 h后，收集上清液及用不含EDTA的胰酶消化的细胞以1 000 r·min－1离心5 min（离心半径为7.5 cm），弃去上清液。用预冷的PBS轻轻重悬细胞洗涤，并转移至已灭菌的1.5 m L 试管中，以12 000 r·min－1离心15 min（离心半径为6 cm）。再次用预冷的PBS轻轻重悬细胞进行洗涤，每管样品加入300μL 已稀释好的1×binding buffer，轻轻重悬。每管样品加入3μL Annexin V-FITC 进行标记，轻轻混匀后，室温避光孵育15 min；之后加入3μL PI染色，于冰浴中轻轻吹打均匀，5 min后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况并计算凋亡率。

2.4 DAPI染色法检测细胞凋亡

用细胞离心涂片机将经不同质量浓度黄芩苷处理的Raji细胞接种于载玻片上，并用质量浓度为40 g·L－1的多聚甲醛进行固定。在含质量浓度为2 g·L－1的Triton X-100的PBS中透化后，在质量浓度为30 g·L－1BSA 的PBS中室温封闭，用PBS漂洗3次，每次5 min，进行DAPI染色，并用盖玻片封片。在荧光显微镜下观察DAPI染色后细胞的凋亡形态并拍照。

2.5 免疫荧光实验

用细胞离心涂片机将经不同质量浓度黄芩苷处理的Raji细胞接种在载玻片上，并用质量浓度为40 g·L－1的多聚甲醛固定。在含质量浓度为2 g·L－1的Triton X-100的PBS中透化后，在质量浓度为30 g·L－1BSA 的PBS中室温封闭，用PBS漂洗3次，每次5 min，加入LC3一抗，4℃过夜。再用PBS漂洗3次，每次5 min，Dylight 488-兔二抗室温避光孵育1.5 h。于激光共聚焦显微镜下观察细胞自噬体的形成情况并拍照。

2.6 Western blot检测Raji细胞蛋白的表达

提取经不同质量浓度黄芩苷处理的Raji细胞的蛋白质样品，并计算各样品中蛋白的含量，用SDSSPAGE凝胶电泳分离蛋白质，用半干转膜仪进行转膜。用质量浓度为50 g·L－1的脱脂牛奶在低速摇床上封闭1 h，用PBS洗膜3次，每次10 min。用一抗进行封闭，一抗的比例分别为p-PI3K（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、p-m TOR（1∶1 000）、LC3-Ⅰ（1∶1 500）

和LC3-Ⅱ（1∶1 500），置于4℃孵育过夜。次日用PBST 在摇床上洗膜3次，每次10 min。加入与一抗种属相对应的HRP标记的二抗，在低速摇床上室温孵育1 h。用PBST 洗膜3次，方法同上。加入ECL发光、显色，以GAPDH 作为内参，用Image Pro Plus软件分析蛋白条带。

2.7 统计学方法

用Graphpad Prism7.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 CCK-8与台盼蓝染色实验结果

用不同质量浓度的黄芩苷处理Raji细胞后24 h，各组之间进行细胞抑制率比较，结果见图1A。与质量浓度0μg·m L－1比较，经质量浓度50、100、200、400、800μg·m L－1黄芩苷处理的细胞抑制率显著升高。将各组数据进一步两两比较，结果显示，各组间的差异均有统计学意义。

台盼蓝染色结果见图1B。用不同质量浓度的黄芩苷处理24 h后统计各组活细胞数，与经质量浓度为0μg·m L－1的黄芩苷处理的细胞比较，经质量浓度为50、100、200、400、800μg·m L－1的黄芩苷处理的细胞抑制率显著升高。进一步进行数据之间的两两比较，结果显示，各组间的差异均有统计学意义。

图1 黄芩苷对Raji细胞增殖的影响Fig.1 Inhibitory effects of baicalin on Raji cells

通过分析以上数据可知，用黄芩苷处理Raji细胞24 h后，IC50值为379.67μg·m L－1，黄芩苷在质量浓度为100～400μg·m L－1时就能显著抑制Raji细胞的增殖。因此，后续实验选取质量浓度梯度为0、100、200、400μg·m L－1的黄芩苷，来探究其对细胞凋亡和自噬过程的作用机制。

3.2 Annexin V-FITC／PI双染法实验结果

Annexin V／FITC-PI双染法流式细胞术检测结果见图2。不同质量浓度黄芩苷作用于Raji细胞24 h后，随着黄芩苷质量浓度的升高，Raji细胞的凋亡率逐渐上升。与用质量浓度为0μg·m L－1黄芩苷处理的细胞比较，用质量浓度为100、200、400μg·m L－1黄芩苷处理的细胞凋亡率显著上升。对数据进行进一步的两两比较，结果显示，各组间的差异均有统计学意义。

图2 不同质量浓度黄芩苷对Raji细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of baicalin on the apoptosis of Raji cells with different mass concentration of baicalin

3.3 DAPI染色检测结果

经不同质量浓度黄芩苷处理后Raji细胞的细胞核发生形态变化，结果见图3。经质量浓度为0μg·m L－1黄芩苷处理的细胞，细胞核结构完整，呈均匀的卵圆形，无细胞核皱缩的现象；随黄芩苷质量浓度的升高（黄芩苷质量浓度为100、200、400μg·m L－1），细胞核发生变形、皱缩，甚至破裂的现象，说明黄芩苷能够诱导Raji细胞发生凋亡。

图3 不同质量浓度黄芩苷处理后Raji细胞核形态的变化Fig.3 Morphological changes of Raji cell nucleus after treatment with different mass concentration of baicalin

3.4 免疫荧光实验结果

为了检测Raji细胞凋亡过程中是否形成自噬体，用免疫荧光实验检测内源LC3，结果显示，经不同质量浓度黄芩苷处理的细胞，自噬体的分布呈现显著差异。经质量浓度为0μg·m L－1黄芩苷处理的细胞，呈现相对均匀的弥漫性荧光，经100、200、400μg·m L－1黄芩苷处理的Raji细胞呈现斑点状荧光，结果见图4，表明LC3在自噬体中发生了再分配。

图4 不同质量浓度黄芩苷处理后Raji细胞内自噬体的分布情况Fig.4 Distribution of autophagosomes in Raji cells after treatment with different mass concentration of baicalin

3.5 Western blot检测相关蛋白的表达

为了检测黄芩苷诱导的细胞凋亡情况，实验检测了经不同质量浓度黄芩苷处理后Raji细胞PI3K、Akt和m TOR 的表达水平，及其相关磷酸化蛋白p-PI3K、p-Akt和p-m TOR 的表达水平，结果见图5。与经质量浓度为0μg·m L－1黄芩苷处理的细胞比较，经质量浓度100、200、400μg·m L－1黄芩苷处理的细胞PI3K、Akt和m TOR 的蛋白表达水平无差异，p-PI3K、p-Akt和p-m TOR 的表达量显著升高，p62蛋白的表达量显著降低。

图5 不同质量浓度黄芩苷对Raji细胞相关蛋白表达量的影响Fig.5 Effect of baicalin on the expression of related proteins in Raji cells with different mass concentration of baicalin

为了检测自噬在黄芩苷诱导细胞凋亡中的作用，实验检测了经不同质量浓度黄芩苷处理后的Raji细胞中自噬相关因子LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62蛋白的表达水平，结果见图6。与经质量浓度0μg·m L－1黄芩苷处理的细胞比较，经质量浓度100、200、400μg·m L－1黄芩苷处理的细胞LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达水平显著升高，p62蛋白的表达量显著降低。

图6 不同质量浓度黄芩苷对Raji细胞自噬相关蛋白表达的影响Fig.6 Effects of baicalin on protein expression in Raji cells related to autophagy with different mass concentration of baicalin

4 讨论

天然中药是近现代治疗肿瘤的宝贵资源，经其提取的化合物的抗肿瘤作用也被越来越多的发现［11］。黄芩苷是具有显著活性的黄酮类化合物，目前已证明其对某些肿瘤具有治疗作用［12］，然而其在淋巴瘤治疗中的作用尚未见报道。

本研究揭示了黄芩苷通过调控PI3K-Aktm TOR 通路，诱导淋巴瘤Raji细胞凋亡和自噬体的发生，进一步促进细胞凋亡及自噬的过程。

细胞凋亡和细胞自噬是细胞中2种主要的程序性死亡，在某些条件的作用下，二者能够共同作用，诱导细胞凋亡［13］。诱导细胞凋亡和自噬的发生一直是治疗血液性恶性肿瘤的重要策略。用CCK-8法和台盼蓝染色法对经不同质量浓度黄芩苷处理的Raji细胞进行染色，结果表明，黄芩苷对淋巴瘤Raji细胞的增殖具有显著的抑制作用，且在质量浓度为100～400μg·m L－1时抑制作用明显，故选取质量浓度梯度为0、100、200、400μg·m L－1进行后续研究。Annexin V-FITC／PI双染法流式细胞术实验结果显示，黄芩苷能够有效诱导Raji细胞的凋亡。细胞凋亡过程涉及一系列基因的激活、表达以及调控等，并伴随凋亡小体的生成和细胞核的皱缩等表现。DAPI染色结果发现，经黄芩苷处理24 h的Raji细胞，其细胞核发生明显的变形和皱缩。为探究Raji细胞凋亡过程中是否发生自噬，进行了内源LC3免疫荧光检测。自噬死亡，即Ⅱ型程序性细胞死亡，通常以自噬体的出现为典型特征。无自噬发生时，LC3 融合蛋白弥散在细胞质中；自噬发生时，LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下呈现出许多明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，因此可以通过计数来评价自噬活性的高低［14］。结果显示，随着黄芩苷质量浓度逐渐增大，显微镜下Raji细胞状态由弥漫性荧光转变为斑点状荧光，表明黄芩苷能够有效诱导Raji细胞发生自噬。

为探究黄芩苷抑制Raji细胞增殖及诱导其凋亡的机制，用Western blot检测相关通路蛋白的表达情况。PI3K-Akt-m TOR 作为肿瘤细胞内重要的信号转导通路之一，与肿瘤的发生和发展关系密切，在多种恶性肿瘤中都可以检测到PI3K-Akt-m TOR 信号通路的转导异常，表明该通路在肿瘤治疗中扮演重要的角色［15］。PI3K 作为信号转导分子，能够激活人体细胞膜上的磷脂酰肌醇，参与调节多种细胞功能。PI3K 磷酸化的最佳靶点是Akt，磷酸化的PI3K 即p-PI3K 将信号传递给Akt后，激活Akt，使Akt磷酸化为p-Akt。一方面p-Akt可以通过其他途径抑制细胞凋亡，另一方面其可直接激活m TOR，使后者的活性增加，进而导致其发生磷酸化最终对细胞凋亡产生抑制作用［16］。Western blot结果显示，黄芩苷处理24 h后，Raji细胞内PI3K、p-PI3K 和Akt蛋白的表达水平无明显变 化，p-Akt、m TOR 和p-m TOR 蛋白的表达水平显著降低，表明黄芩苷能够抑制PI3KAkt-m TOR 通路的信号转导，降低其对于凋亡的抑制作用，进而达到诱导细胞凋亡的作用。

为进一步探究自噬在由黄芩苷诱导的细胞凋亡中的作用，实验检测了经不同质量浓度黄芩苷处理后的Raji细胞中自噬相关因子LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62蛋白的表达水平。LC3 是一种自噬体标志蛋白，其存在2 种可相互转化的形式，即LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。细胞质内可溶形式为LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ经剪切和修饰，转变为位于胞内自噬体膜上的膜结合形式的LC3-Ⅱ。LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ随自噬体膜的增多而增多。因此，可通过Western blot检测LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表达水平，进而判断细胞的自噬活性［17］。p62 是一种泛素结合蛋白，它能与LC3直接作用，参与自噬过程并被降解。p62蛋白的水平与自噬的活性成反比，在自噬被抑制时，p62蛋白的表达水平升高，因此，p62蛋白的表达水平可反映自噬活性的强弱［18］。Western blot结果显示，黄芩苷能够显著提高LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表达水平，显著降低p62的表达水平，表明黄芩苷能够通过提高LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表达水平，抑制p62的表达，从而提高自噬的活性，减弱溶酶体的降解作用，进而诱导Raji细胞自噬的发生。

综上所述，黄芩苷能够诱导Raji淋巴癌细胞凋亡和自噬的发生，其可能通过下调PI3K-Akt-m TOR 信号转导通路相关蛋白的表达水平发挥作用。