定量沉默c-Met基因表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和化疗敏感性的影响*

王金西，郭晓娟，程锦红，张绍东，焦保庭

(1.河北省邯郸市第一医院普外四科 056002；2.河北省邯郸市中心医院病理科 056001)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率位居高位，且发病率有逐年升高的趋势，逐渐成为影响女性健康的首位恶性肿瘤[1]。化疗是临床治疗乳腺癌的主要手段之一，但随着化疗药物的长期应用，患者易对化疗药物产生抗药性,影响化疗的效果[2]。这一现象严重影响了乳腺癌患者的生存质量及疾病预后[3-4]。作为传统的化疗药物，表阿霉素被认为是治疗乳腺癌最常用和有效的药物。然而，如何提高癌细胞对表阿霉素药物的敏感性目前已成为一个重要的临床问题。c-Met是一种原癌基因，属于酪氨酸激酶受体家族，其配体为肝细胞生长因子(hepato-cyte growth factor，HGF)[5]，c-Met与HGF结合形成同源二聚体，可使酪氨酸磷酸化并激活下游信号通路。c-Met基因失调或活化与人类肿瘤的发生、发展有密切联系。过去的几十年中，多项研究证实c-Met在乳腺癌组织中过表达，与其相关的信号通路与乳腺癌的发展、预后密切相关[6]。QUE等[7]研究发现，在骨髓瘤细胞中抑制c-Met的表达可以提高肿瘤细胞对阿霉素化疗的敏感性。严婧等[8]研究报道，抑制c-Met信号通路可增加白血病细胞株对硼替佐米的化疗敏感性。因此，针对c-Met的靶向治疗可以为肿瘤耐药后的治疗提供新的策略及方法。

1 材料与方法

1.1 材料

乳腺癌MDA-MB-231细胞株购于上海生命科学院细胞库，胎牛血清购于美国Hyclone公司，RPMI1640培养基、DMEM培养基购于迈晨科技(北京)有限公司，嘌呤霉素购于美国Sigma公司，鼠抗人c-Met单抗购于德国CalBiochem公司，噻唑蓝(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)购于北京索莱宝生物技术有限公司，鼠抗人Cleaved 多聚二磷酸腺苷(ADP)-核糖聚合酶(PARP)、Cleaved 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)一抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔二抗IgG 均购于美国Cell signaling公司；兔抗人三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)单抗购于美国Santa Cruz公司。流式细胞检测用试剂盒购于美国Invitrogen公司；表阿霉素购于美国Sigma公司。

1.2 方法

首先参考文献查找针对c-Met的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)，TA载体构建并筛选沉默效果最佳的shRNA，进行慢病毒包装，收集病毒液感染MDA-MB-231细胞，用嘌呤霉素筛选出稳定细胞系PSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231，鉴定稳定细胞系[9]。

1.2.1细胞培养

MDA-MB-231细胞(空白对照)、PSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231细胞、PSD400-scramble-MDA-MB-231细胞(阴性对照)均培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，每隔2 d更换培养基，0.25%的胰酶消化传代。

1.2.2筛选最佳多西环素(Doxycycline，DOX)诱导浓度

选择对数增长期的pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，5×105/孔,向培养基中加入DOX进行诱导，终浓度分别调整为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg/mL。培养72 h后提取细胞蛋白，进行Western blot检测，根据c-Met蛋白表达水平筛选出最适合的DOX浓度。最终选择0.4 μg/mL。

1.2.3细胞诱导

将对数生长期的3种细胞用0.25%胰酶消化，接种于6孔板中，每孔加入5×105个细胞、2 mL培养基，设置复孔，加入DOX，使终浓度为0.4 μg/mL，吹打均匀，诱导48 h。

1.2.4MTT法检测适当敲除c-Met基因后对细胞增殖的影响

把3种细胞接种在6孔板中，每孔接种4×105个细胞，每种细胞分成两组即有DOX诱导组(+DOX)和无DOX诱导组(-DOX)。待细胞贴壁后加入DOX(0.4 μg/mL)进行诱导，诱导3 d后将细胞接种于96孔板中，每孔接种1.5×103个细胞。设置6个实验组(+DOX shRNA、+DOX scramble、+DOX MDA-MB-231、-DOX shRNA、-DOX scramble、-DOX MDA-MB-231)，每组设5个复孔，6个观察时间点。为防止边缘效应周边各孔加入200 μL的磷酸盐缓冲液(PBS)。各组细胞在37 ℃、5% CO2条件下培养。分别于12、24、48、72、96、120 h时间点检测。检测时每孔加入 20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，在37 ℃温箱避光孵育4 h，然后去掉96孔板中的培养基，每孔加入150 μL DMSO，将96孔板振荡10 min。用酶标仪检测490 nm波长下的吸光度(A490)值，并处理数据。

1.2.5MTT检测细胞对表阿霉素的化疗敏感性

将诱导的3种细胞及对照组细胞胰酶消化后接种于96孔板中，每孔按照2×103/mL接种，分别加入终浓度为0、0.25、0.5、1、5、10 μg/mL的表阿霉素药物，每个浓度设置3个复孔，并设置调零孔及空白对照孔。用MTT法检测A490值。计算细胞存活率。使用GraphPad Prism6.0软件计算细胞的药物半数抑制浓度(IC50)并绘制细胞存活率曲线。

1.2.6流式细胞仪检测细胞周期分布

将诱导的3种细胞及对照组细胞胰酶消化后接种于6孔板中，每孔接种细胞5×105个，置于37 ℃、5% CO2温箱孵育24 h后去掉原培养基，加入含表阿霉素药物的培养基，使终浓度为5 μg/mL，培养48 h后去掉原培养基，用无酶消化液[含0.04%乙二胺四乙酸(EDTA)]处理细胞制成细胞悬液，用PBS洗涤并重悬细胞，调整细胞密度为2×105/mL，取1 mL单细胞悬液，离心去上清液，加入1 mL 70%的预冷乙醇，4 ℃固定过夜。染色前用PBS洗涤2次，加入100 mg/L核糖酸酶A(RNaseA)，37 ℃水浴30 min。再加入500 μL(50 mg/L)碘化丙啶(PI)染色液混匀，4 ℃避光反应30 min后，转移至流式细胞仪进行检测，每组重复3次。流式细胞仪检测细胞周期，计算 G0/G1期、S期和G2/M期细胞百分比。

1.2.7Western blot检测细胞中PARP、caspase-3表达

将3种细胞于37 ℃、5% CO2孵育24 h后弃去原培养基，加入含终浓度为5 μg/mL表阿霉素的培养基，培养48 h后收集各组细胞，提取细胞总蛋白，每组设3个复孔。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、电转膜至甲醛预处理过的聚偏氟乙烯(PVDF)膜密封2 h，洗膜并分别以鼠抗人Cleaved PARP 、Cleaved caspase-3单克隆抗体作为一抗，在4 ℃下孵育过夜，洗膜加入辣根过氧化物酶标记的二抗，于室温下孵育2 h。再用电化学发光(ECL)显示，收集影像，以GAPDH作为内参，采用凝胶图像处理系统软件分析各组的条带灰度值。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 筛选最佳DOX诱导浓度

将嘌呤霉素筛选出来的稳定细胞系pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231用不同浓度的DOX进行诱导，然后Western blot检测c-Met蛋白表达，结果显示c-Met蛋白表达水平随着DOX浓度增加逐渐降低，当DOX浓度在0.5 μg/mL时，c-Met蛋白几乎不表达。为了避免因c-Met基因被完全敲除而导致细胞死亡，选择DOX浓度为0.4 μg/mL，见图1。

shRNA：pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231细胞组；scramble：pSD400-scramble-MDA-MB-231细胞组。

2.2 适当沉默c-Met基因后对MDA-MB-231细胞增殖的影响

3种细胞株接种在96孔板中并加入DOX(浓度：0.4 μg/mL)进行诱导，诱导时间分别为12、24、48、72、96、120 h，在各时间点进行MTT检测，读取A490值。由于可诱导shRNA是建立在四环素操纵子(TetO)系统基础上的慢病毒载体，稳定细胞系在常规培养时与一般细胞无明显差异，当培养基中加入DOX后，便可诱导稳定细胞系合成shRNA，从而对目的基因进行定量沉默。实验结果显示，pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231细胞株中经过DOX诱导的细胞(有DOX诱导组)c-Met基因被适当沉默，细胞增殖受到抑制，随着时间的延长抑制越来越明显，与无DOX诱导组相比有明显差异(P<0.05)；而阴性对照组及空白组细胞无论有无DOX诱导，细胞增殖无明显差异(P>0.05)。DOX诱导后pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231细胞c-Met基因被适当沉默，较pSD400-scramble-MDA-MB-231细胞增殖明显受到抑制(P<0.05)，见图2。

A：加/不加DOX适当沉默c-Met后对pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231细胞增殖的变化；B：加/不加DOX对pSD400-scramble-MDA-MB-231细胞增殖的变化；C：加/不加DOX对MDA-MB-231细胞增殖的变化；D：DOX诱导后pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231细胞和pSD400-scramble-MDA-MB-231细胞增殖的变化；shRNA-c-Met:pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231细胞;scramble:pSD400-scramble-MDA-MB-231细胞。

2.3 适当沉默c-Met基因后MDA-MB-231细胞对表阿霉素的化疗敏感性检测

DOX诱导细胞后，给予不同浓度表阿霉素作用，采用MTT法检测其对细胞存活率的影响。结果显示，适当沉默MDA-MB-231细胞c-Met基因表达(有DOX诱导组)，其细胞存活率随着表阿霉素浓度的增加较无沉默c-Met细胞(无DOX诱导组)呈现明显降低的趋势，阴性对照组及空白细胞组无明显差异。经过DOX诱导、表阿霉素处理后pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231细胞株IC50为1.23 μg/mL，无DOX诱导组IC50为4.92 μg/mL，差异有统计学意义(P<0.05)。pSD400-scramble-MDA-MB-231细胞株中有DOX诱导组IC50为5.56 μg/mL，无DOX诱导组IC50为5.13 μg/mL；MDA-MB-231细胞株中有DOX诱导组IC50为5.46 μg/mL，无DOX诱导组IC50为5.68 μg/mL；两种细胞株有、无DOX诱导组IC50比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见图3。

A：加/不加DOX适当沉默c-Met后联合表阿霉素对pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231细胞存活率的影响；B：加/不加DOX联合表阿霉素对pSD400-scramble-MDA-MB-231细胞存活率的影响；C：加/不加DOX对MDA-MB-231细胞存活率的影响。

2.4 适当沉默c-Met基因表达联合表阿霉素作用后对细胞凋亡的影响

3种细胞经DOX诱导后，加入4 μg/mL表阿霉素，经48 h后利用流式细胞仪检测细胞的周期分布情况。结果显示，pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231细胞株经DOX诱导的细胞(有DOX诱导组)G0/G1期细胞百分比为(53.7±1.42)%，S期及G2/M期细胞百分比降低，分别为(38.1±1.13)%、(8.2±0.78)%，差异有统计学意义(P<0.05)；而未经DOX诱导的细胞(无DOX诱导组)G0/G1期细胞百分比为(33.5±1.18)%。pSD400-scramble-MDA-MB-231细胞株中有、无DOX诱导组G0/G1期细胞百分比[(32.2±1.26)%vs.33.4±1.12%)]和MDA-MB-231细胞株中有、无DOX诱导组G0/G1期细胞百分比[(32.7±1.31)%vs.(33.1±1.42%)]均无明显差异(P>0.05)，见图4。

A：加/不加DOX适当沉默c-Met后联合表阿霉素pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231细胞周期的变化；B：加/不加DOX适当沉默c-Met后联合表阿霉素pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231细胞不同周期细胞百分比；C：加/不加DOX联合表阿霉素pSD400-scramble-MDA-MB-231细胞周期的变化；D：加/不加DOX联合表阿霉素pSD400-scramble-MDA-MB-231细胞不同周期细胞百分比；E：加/不加DOX MDA-MB-231细胞周期的变化；F：加/不加DOX MDA-MB-231细胞不同周期细胞百分比。

2.5 Western blot检测细胞凋亡蛋白表达

适当敲除MDA-MB-231细胞c-Met基因后联合表阿霉素，Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白PARP、caspase-3的表达变化。结果显示，pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231细胞株Cleaved PARP、Cleaved caspase-3表达水平增加明显，而pSD400-scramble-MDA- MB-231细胞株无论有无DOX诱导，Cleaved PARP、Cleaved caspase-3表达水平无明显差异，见图5。

shRNA-c-Met：pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231细胞；scramble：pSD400-scramble-MDA-MB-231细胞。

3 讨 论

化疗目前仍为乳腺癌主要的治疗方法，但癌细胞对化疗药物的耐药性是影响乳腺癌患者预后的主要障碍。表阿霉素由于抗肿瘤效果好且价格低廉，目前为乳腺癌化疗常用药物，但其严重的心脏毒性及骨髓抑制，使不少乳腺癌患者不能完成整个化疗疗程。如何增加乳腺癌细胞对表阿霉素的敏感性显得尤为重要。

c-Met是一种原癌基因，HGF是其配体，属于受体酪氨酸蛋白激酶家族成员[10]。肿瘤的侵袭性、脉管浸润、淋巴结转移、远处转移、耐药性及预后与c-Met过度表达密不可分[11]。因此，c-Met可能是一个潜在的肿瘤治疗靶点，其抑制剂的研究现已成为肿瘤治疗领域的热点。过去很多年的研究中证实，乳腺癌组织中c-Met呈过表达，乳腺癌的发展及预后与c-Met相关的信号通路有密切关系[12]。c-Met抑制剂SGX523能明显抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖并诱导细胞凋亡，使细胞周期G0/G1期阻滞，这一研究被冯炜红等[13]证实，这为c-Met靶向治疗的临床转化提供了良好的实验及理论基础。

RNA干扰(RNAi)是有效沉默或抑制目标基因表达的过程。RNAi沉默机制是由小干扰RNA(siRNA)或shRNA诱导实现靶mRNA的降解，或者通过微RNA(miRNA)诱导特定mRNA翻译的抑制[14]。目前shRNA慢病毒载体被广泛地用于RNAi研究中，这得益于shRNA在宿主细胞中能高效、长期稳定地表达。本研究所采用的可诱导shRNA是建立在TetO系统基础上的诱导系统，它含有TetO序列，后者可以与四环素阻遏蛋白(TetR)结合并能阻止TetO的启动子启动shRNA的转录。四环素(Tet)或DOX可以与TetR结合，可使TetR的结构发生改变，最终导致TetO序列上的TetR脱落，使shRNA转录表达。

多项实验研究证实，在多种肿瘤细胞中shRNA对c-Met的沉默是有效的[15-16]。本次研究成功构建针对c-Met的shRNA稳定细胞系，该细胞系常规培养时与阴性对照组无差别，不表达shRNA，在加入DOX诱导后，稳定细胞系可表达shRNA，从而导致稳定细胞c-Met蛋白表达水平降低，细胞增殖能力受到抑制。前期研究发现，如果完全敲除细胞c-Met基因后细胞会死亡，所以本研究选择可调控沉默c-Met基因的慢病毒载体系统进行后续实验。在实验中发现DOX浓度在0.4 μg/mL时c-Met沉默率可达80%左右，所以最终选择DOX诱导浓度为0.4 μg/mL。适当敲除MDA-MB-231细胞c-Met基因后加入表阿霉素联合作用，发现MDA-MB-231细胞的增殖明显受到抑制，同时促进了细胞的凋亡。乳腺癌细胞对表阿霉素作用的IC50由4.92 μg/mL降至1.23 μg/mL，细胞增殖活性明显降低，这与QUE等[17]的研究结果一致。同时适当沉默c-Met基因与表阿霉素联合作用诱导细胞出现G1期阻滞，从而抑制细胞的增殖。这些结果或许说明针对肿瘤细胞中特定的原癌基因，调控其在肿瘤细胞中的表达，对于有效提高化疗药物对肿瘤细胞的细胞毒性具有重要作用。

本次研究结果也表明，适当沉默MDA-MB-231细胞c-Met基因表达联合表阿霉素作用后，细胞中凋亡相关蛋白PARP和caspase-3表达水平增高。目前已经证实caspase-3及其底物PARP在细胞凋亡中起重要作用。当细胞DNA受损严重时可以激活caspase-3，从而介导细胞凋亡，此时PARP被caspase-3裂解。裂解的PARP切断烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)合成时对三磷酸腺苷(ATP)的消耗，促使细胞凋亡的完成[17]。PARP常被用作细胞凋亡的指标。本研究中适当敲除c-Met后，MDA-MB-231细胞上调caspase-3和PARP表达，结果表明shRNA对c-Met基因适当敲除联合表阿霉素引起caspase相关细胞凋亡，这可能是导致细胞活性下降的部分原因。这与QUE等[7]研究结果一致，该研究显示shRNA靶向c-Met可诱发U266细胞caspase依赖性凋亡。本研究显示，在pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231细胞(有DOX诱导组)中细胞增殖能力的下降与凋亡率的增加关系密切，并且细胞周期阻滞发生在G0/G1期。

肿瘤耐药性是导致乳腺癌患者治疗失败和死亡的重要原因。在本研究中，下调c-Met表达可以增加乳腺癌细胞MDA-MB-231对表阿霉素的敏感性，表明c-Met可能是乳腺癌的辅助化疗靶点。作者认为，除了MDA-MB-231细胞以外，本研究还应分析更多的乳腺癌细胞，以证实适当敲除c-Met基因对乳腺癌细胞增殖、侵袭的抑制作用，以及增加乳腺癌细胞对表阿霉素化疗敏感性的作用。此外，除了研究下调c-Met对表阿霉素的化疗敏感性外，还应分析其他化疗药物的化疗敏感性。因此，适当敲除c-Met基因产生的抗癌作用有待进一步研究。