基于普鲁士蓝纳米花/电化学还原石墨烯复合修饰玻碳电极伏安检测血清中多巴胺的浓度

夏用恢，李广利，胡长平（1.中南大学湘雅药学院药理学系，长沙 410078；2.株洲市食品药品检验所，湖南 株洲 412011；.湖南工业大学生命科学与化学学院，湖南 株洲 412007）

多巴胺作为一种重要的儿茶酚类神经递质，在中枢神经、心血管、肾脏、激素等生理功能调节中起着重要的作用[1]。多巴胺水平异常可能引发帕金森病等多种神经精神类疾病，严重危害人体健康。因此，发展低成本、高灵敏度的多巴胺检测方法对疾病的预防和诊断具有重要意义。目前多巴胺的主要测定方法包括荧光法[2]、色谱法[3-4]、电化学发光法[1，5]等。这些方法尽管可靠，但往往需要昂贵的仪器设备、预处理步骤烦琐耗时。电化学分析法具有成本低、响应快速、灵敏度高、设备简单便携等优点[6-8]，已广泛用于多巴胺等生物活性分子的检测。由于多巴胺常与抗坏血酸和尿酸共存于血清和中枢系统细胞外液中，且三者在裸电极上的氧化峰电位接近，因此多巴胺电化学检测容易受到干扰[9-10]。金属纳米粒子[11]、碳纳米管[12-13]、石墨烯[14-16]等纳米材料能显著提升电极的选择性，已成为解决干扰问题的主要方法。普鲁士蓝（Prussian blue，PB）是一种混合价态的铁化合物，具有无毒、成本低、电化学性能优异等特点，在分子磁体、电致变色器件、电催化、能量转换等领域应用广泛[17]。目前，基于普鲁士蓝/石墨烯复合材料电化学检测多巴胺水平的方法尚未见报道。本文拟发展基于普鲁士蓝纳米花/电化学还原石墨烯复合材料修饰玻碳电极（Prussian blue nanoflower/ electrochemically reduced graphene oxide modified glassy carbon electrode，PB/ ErGO/GCE），以期利用PB与电化学还原石墨烯的协同增敏作用以提高多巴胺的电化学传感性能。

1 材料

铁氰化钾[K3Fe（CN）6]、亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6]、无水磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠、氯化钾、盐酸、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）等试剂均为分析纯（国药化学试剂有限公司）；盐酸多巴胺（分析纯，上海阿拉丁生化股份有限公司）；氧化石墨烯（GO，南京先丰纳米材料有限公司）；所有溶液均用超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm-1）配制。人血清样品由株洲市人民医院提供。

2 方法

2.1 普鲁士蓝纳米花合成

PB采用低共熔溶剂辅助水热合成法[18]。具体合成步骤如下：准确称取0.0320 g K3Fe（CN）6加入100 mL烧杯，在烧杯中分别加入5 mL超纯水、5 mL盐酸和25 mL DMF，磁力搅拌至完全溶解。将上述混合液转移至100 mL聚四氯乙烯内纯不锈钢反应釜中，80℃下水热处理24 h。待反应结束后，取出水热反应釜，自然条件下冷却至室温，将反应溶液以8000 r·min-1转速离心，得到的产物依次用超纯水、无水乙醇、超纯水洗涤3次后，置于80℃的烘箱干燥过夜，即可得到花状结构的PB。将10 mg PB分散于10 mL超纯水中，超声30 min，即可得到1 mg·mL-1的PB分散液。

2.2 PB/GO复合材料制备

将10 mg GO分散于10 mL超纯水中，超声30 min，得到分散均匀的GO分散液（质量浓度为1 mg·mL-1）。将上述制得的PB分散液和GO分散液按体积比1∶10进行混合，超声分散30 min，即得PB/GO复合材料分散液。

2.3 PB/ErGO复合修饰电极制备

分别使用0.3 μm和0.05 μm Al2O3抛光粉将玻碳电极（GCE）[高仕睿联（天津）光电科技有限公司]表面抛光至镜面，然后将电极分别置于超纯水、无水乙醇、超纯水中超声1 min，并置于红外灯下干燥备用。采用滴涂法制备PB/GO/GCE，再经电化学还原法将GO还原即可制得PB/ErGO/GCE。具体制备方法如下：用移液枪移取5 μL PB/GO分散液，滴涂于GCE表面，置于红外灯下干燥，即得PB/GO/GCE。采用恒电位法还原，将PB/GO/GCE在-1.5 V还原电位还原120 s，即可制得PB/ErGO/GCE。

2.4 电化学测量

所有电化学实验均在CHI 660E电化学工作站（上海辰华）进行。电化学测试采用标准三电极体系，以裸电极或修饰电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。采用循环伏安法和电化学阻抗谱表征PB/ErGO/GCE的电化学性能。采用差分脉冲伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）定量检测人血清中多巴胺的含量。

3 结果与讨论

3.1 形貌及微观结构表征

图1为PB、GO及PB/GO的扫描电镜图谱。PB呈现分散且均匀的花状结构，直径在500～800 nm（见图1A）。GO呈薄层弯曲绵延起伏状态，表面具有褶皱结构（见图1B）。图1C可以清楚地看到GO絮状薄层覆盖包裹PB，表明成功合成了PB/GO。

图1 PB（A）、GO（B）及PB/GO（C）的扫描电镜图谱Fig 1 Scanning electron microscopy images of PB（A），GO（B），and PB/GO composites（C）

图2为PB、GO及PB/GO的X-射线粉末衍射图谱。GO在2θ为9.82°处出现明显的衍射峰，这归属于（001）晶面。PB在2θ为17.49°、24.87°、35.50°、39.66°、43.80°、50.79°、54.18°、57.49°处出现明显的衍射峰，分别对应（200）、（220）、（400）、（420）、（422）、（440）、（600）和（620）晶面，与PB标准卡（JCPDS NO.73-0687）吻合。PB/GO的X-射线粉末衍射图谱中可以清楚地看到GO和PB的特征衍射峰，表明PB/GO复合材料成功合成，PB/GO复合材料中PB的特征衍射峰变弱，这主要是由于PB与GO的质量比为1∶10，大量存在的GO部分掩盖了PB的特征衍射峰所致。

图2 PB、GO及PB/GO的X-射线粉末衍射图谱Fig 2 X-ray powder diffraction patterns of PB，GO，and PB/GO composites

3.2 电化学性能表征

图3A为GCE、ErGO/GCE、PB/GCE和PBErGO/GCE在5 mmol·L-1K3Fe（CN）6、K4Fe（CN）6和0.1 mol·L-1KCl混合液中的循环伏安曲线。GCE、ErGO/GCE、PB/GCE和PB/ErGO/GCE的还原峰电流值依次增加，分别为95.34、140.6、146.2、175.2 μA。根据Randles-Sevcik方程，可计算GCE、PB/GCE、ErGO/GCE和PB/ErGO/GCE的电化学活性面积分别为0.0814、0.125、0.119、0.149 cm2。PB/ErGO/GCE表面活性面积最大，能为多巴胺的电化学氧化提供更多的吸附位点和催化活性位点。此外，还检测了不同电极在5 mmol·L-1K3Fe（CN）6、K4Fe（CN）6和0.1 mol·L-1KCl混合液中的电化学阻抗谱，见图3B。从图中可以看，所有电极的阻抗谱均由半圆和直线组成。高频区的半圆部分受电子传输控制，其直径相当于电极表面的电子转移阻抗（Rct）；低频区的直线部分受扩散控制。显然，裸电极的半圆最大，Rct最大。修饰PB或ErGO后，电极的Rct显著降低。PB/ErGO/GCE的半圆半径最小，Rct最低，表明PB/ErGO能显著降低电子在多巴胺与电极表面之间的传输阻力，从而提高PB/ErGO的电化学传感性能。

图3 不同电极在5 mmol·L-1 K3Fe（CN）6、K4Fe（CN）6（1∶1）和0.1 mol·L-1 KCl混合溶液中的循环伏安曲线（A）和电化学阻抗谱（B）Fig 3 Cyclic voltammetry（A）and electrochemical impedance spectroscopy（B）of different electrodes in a mixed solution of 5 mmol·L-1 K3Fe（CN）6，K4Fe（CN）6（1∶1）and 0.1 mol·L-1 KCl

3.3 多巴胺在修饰电极上的电化学行为

图4为1.0 μmol·L-1多巴胺在不同电极上的DPV曲线。多巴胺在裸电极上的阳极峰非常微弱，响应峰电流最小（ipa＝0.398 mA）。在PB/GCE上，多巴胺的阳极峰电流显著增大，约为裸电极的8倍（ipa＝3.139 mA），这主要是由于PB对多巴胺具有优异的催化性能。在ErGO/GCE上，多巴胺的阳极峰电流约为裸电极的12倍（ipa＝4.916 mA），这主要是由于ErGO具有高的比表面积和优异的导电性等性能，有效增强了电化学活性面积，降低了电子传输阻力。而且ErGO与多巴胺的π-π相互作用进一步增强了多巴胺在电极表面的吸附能力。在PB/ErGO/GCE上，多巴胺的响应峰电流高达21.29 mA，约为裸电极的53倍，表明PB和ErGO对多巴胺的氧化具有协同催化效应。

图4 1.0 μmol·L-1多巴胺在不同电极上的DPV曲线Fig 4 DPV curve for 1.0 μmol·L-1 dopamine recorded at various electrodes

3.4 多巴胺测定条件优化

3.4.1 富集条件优化 首先检测了富集时间对多巴胺阳极响应峰电流的影响。如图5A所示，随着富集时间的不断延长，多巴胺阳极峰电流逐渐增大；富集时间为240 s时，多巴胺阳极峰电流最大；继续延长富集时间，多巴胺阳极峰电流基本不变，表明多巴胺在PB/ErGO/GCE表面吸附达到饱和，故最佳富集时间为240 s。在最佳富集时间240 s下，进一步检测富集电位对多巴胺阳极峰电流的影响。如图5B所示，当富集电位从-0.3V正移至0 V，多巴胺阳极峰电流不断增大；当富集电位进一步正移，多巴胺阳极峰电流反而下降，故最佳富集电位为0 V。

图5 富集时间（A）和富集电位（B）对1.0 μmol·L-1 多巴胺阳极峰电流的影响Fig 5 Effect of accumulation time（A）and accumulation potential（B）on the anodic peak current of 1.0 μmol·L-1 dopamine

3.4.2 底液pH优化 图6A为多巴胺在底液pH 3.0～8.0的DPV曲线，随着底液pH不断增大，多巴胺的阳极峰不断往负电位方向移动，表明质子（H＋）参与多巴胺的电化学氧化过程。当底液pH从3.0增加7.0，多巴胺阳极峰电流随pH增大而增大；当底液pH大于7.0，继续增大pH，多巴胺阳极峰电流却降低（见图6B）。因此，最适底液pH为7.0，接近于生物体液的pH，有利于血清、尿液等生物样本的检测。多巴胺阳极峰电位（Epa）与底液pH呈良好的线性关系（见图6C），线性回归方程为Epa（V）＝-0.481pH＋0.535（R2＝0.9972）。该方程的斜率接近于能斯特方程理论值（-0.0592V/pH），表明多巴胺在PB/ErGO/GCE的电化学氧化过程为等电子等质子过程。

图6 不同底液pH下多巴胺在PB/ErGO/GCE的DPV曲线（A）及多巴胺阳极峰电流（B）、峰电位与pH关系（C）图Fig 6 DPV curve of dopamine in different pH buffer solution（A）and relationship between pH and anodic peak current（B）or peak potential（C）of dopamine

3.4.3 扫速优化 为了探究多巴胺在PB/ErGO/GCE的氧化机制，记录了不同扫速下多巴胺的循环伏安曲线。如图7A，随着扫速的增加，阳极峰电流（ipa）和阴极峰电流（ipc）均增大。ipa、ipc均与扫速（v）呈良好的线性关系，表明多巴胺在PB/ErGO/GCE上主要受吸附控制。而且多巴胺的阳极峰电位（Epa）随着扫速的增加向正电位方向移动，阴极峰电位（Epc）则负移。Epa、Epc均与扫速的自然对数（lnv）呈良好的线性关系，线性回归方程分别为Epa＝0.0228lnv＋0.245（R2＝0.9821）和Epc＝0.0119lnv＋0.098（R2＝0.9883）。对于吸附控制的准可逆过程，结合Lavrion[19]方程可计算电子转移数（n）约为2.0。因此，多巴胺在PB/ErGO/GCE的氧化为2电子2质子转移过程，其机制如图8所示。

图7 多巴胺峰电流（A）及峰电位（B）与扫速的线性关系图Fig 7 Linearity between the peak current（A）and peak potential（B）of dopamine and napierian logarithm of scanning rate

图8 多巴胺在PB/ErGO/GCE上的电化学氧化还原机制Fig 8 Electrochemical redox mechanism of dopamine on PB/ErGO/GCE

3.5 线性范围和检出限

在最佳检测条件下，采用DPV对多巴胺进行定量测定。如图9A所示，多巴胺浓度为0.5～50 μmol·L-1时，随着多巴胺浓度的增加，多巴胺阳极峰电流（ipa）随浓度（C）的增加而不断增大。而且多巴胺阳极峰电流与浓度的自然对数呈良好的线性关系（见图9B），其线性回归方程可表示ipa（μA）＝16.30lnC＋22.40（R2＝0.9963）。检出限为0.06 μmol·L-1。PB/ErGO/GCE的传感性能与文献报道[20-24]的修饰电极相当（见表1），表明该电极具有较大的应用前景。

图9 不同浓度多巴胺在PB/ErGO/GCE上的DPV曲线（A）及多巴胺阳极峰电流与浓度自然对数的线性关系图（B）Fig 9 DPV curve of different concentration dopamine at PB/ErGO/GCE（A）and linearity between anodic peak current of dopamine and napierian logarithm of their concentration（B）

表1 PB/ErGO/GCE的传感性能与文献报道比较 Tab 1 Sensing performance between the PB/ErGO/GCE and previously reported electrodes

3.6 重复性、再现性和选择性

为考察电极的重复性，同一电极PB/ErGO/GCE连续7次测量1 μmol·L-1多巴胺的响应峰电流，结果相对标准偏差（RSD）为5.6%，表明PB/ErGO/GCE具有良好的重复性。为考察电极的再现性，采用相同方法制备的5根PB/ErGO/GCE平行测量1 μmol·L-1多巴胺的响应峰电流，其RSD为3.2%，表明该修饰电极具有优异的再现性。尿酸、抗坏血酸常与多巴胺共存于血清等生物体液中，且它们的氧化峰电位相近，容易对多巴胺的检测产生干扰。为考察PB/ErGO/GCE的选择性，分别测定1 μmol·L-1多巴胺在100倍浓度的尿酸与抗坏血酸共存下的响应峰电流，实验结果表明，在100倍浓度尿酸与抗坏血酸共存下，相对误差均低于5.0%，表明PB/ErGO/GCE具有优异的选择性。

3.7 实际样品检测

使用PB/ErGO/GCE检测人血清中的多巴胺浓度以验证修饰电极的实用性。将4份人血清样品用0.1 μmol·L-1PBS（pH＝7.0）稀释10倍，得到待测的人血清样品。采用DPV定量测定人血清样品中多巴胺浓度，检测结果见表2。1号血清样品多巴胺浓度为0.64 μmol·L-1。2～4号人血清样品均未出现多巴胺响应峰电流，表明未检出多巴胺。加标回收试验中的回收率为95.5%～100.6%，表明PB/ErGO/GCE能精确检测实际样品中多巴胺的浓度。

表2 人血清中多巴胺浓度测定(n＝3) Tab 2 Detection of dopamine concentration in human serum samples (n＝3)

4 结论

本文制备了一种基于PB/ErGO复合纳米材料的多巴胺电化学传感器，成功实现了人血清中多巴胺浓度的检测。PB/ErGO显著增大了多巴胺的电化学活性面积，促进了电子在电极表面与多巴胺之间的传递。PB/ErGO对多巴胺的电化学氧化表现出明显的协同增敏效应，极大地提高了多巴胺的电化学响应。PB/ErGO/GCE对多巴胺表现出优异的传感性能，动态响应范围为0.5～50 μmol·L-1，检出限为0.06 μmol·L-1。PB/ErGO/GCE能准确检测人血清中多巴胺的含量，回收率为95.5%～100.6%。鉴于其具有低成本，高灵敏度，优异的重复性、再现性和稳定性等优点，PB/ErGO/GCE在生物样品中多巴胺的痕量检测上具有实际应用前景。