结直肠癌组织中miRNA-371-5p表达意义的研究

韩 悦，王贲士

（1山东省立第三医院胃肠外科，济南 250031；2山东省肿瘤医院胃肠外科，济南 250106）

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是常见的恶性肿瘤，其发病率位于所有恶性肿瘤的第3 位，死亡率位于第2位[1]。癌转移是导致CRC患者死亡的重要原因之一，近年来CRC 的防治取得了长足的进步，但是晚期和转移患者5年生存率仅为15%[2]。因此寻找预测肿瘤病情进展的标记物，探究影响预后的相关因素非常重要。微小RNA（miRNA）是单链非编码RNA，在基因转录水平和转录后水平进行负性调控[3]。既往研究已证实，miRNA 与CRC 的发生和发展密切相关[4-5]。研究发现，miRNA-371-5p属于基因间miRNA，miRNA-371-5p 可以抑制CRC LoVo 和SW620 细胞的增殖，对凋亡无明显影响[6]。本研究检测CRC 组织及细胞中miRNA-371-5p 的表达，分析miRNA-371-5p 与患者生存预后的关系，在体外研究中观察上调miRNA-371-5p 对CRC 细胞增殖、侵袭和迁移的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料以2011 年1 月-2013 年1 月山东省立第三医院胃肠外科收治的186 例CRC 患者为研究对象，回顾性分析患者的基本资料：男性112例，女性74例；年龄32～85岁，平均年龄（65.5±6.2）岁；肿瘤位于结肠88 例，直肠98 例；肿瘤直径≥5 cm 96 例，<5 cm 90 例；有淋巴结转移86 例，无转移100 例；高分化10例，中分化145 例，低分化31 例；肿瘤淋巴结转移分类（Tumor node metastasis classification，TNM）分期为Ⅰ期28 例，Ⅱ期58 例，Ⅲ期75 例，Ⅳ期25 例。本研究通过山东省立第三医院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 细胞和试剂结肠癌细胞HT29、SW480、SW620和HCT116，正常人肠上皮细胞HIEC-6 购于中科院上海细胞库。胎牛血清（上海浩洋生物科技有限公司），RPMI-1640 培养基（上海浩洋生物科技有限公司），LipofectAMINETM2000 转染试剂（上海浩洋生物科技有限公司），miRNA-371-5p 模拟物和对照质粒（深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司）。反转录试剂盒（上海吉玛公司），2×SYBR Green PCR Mas⁃termix 试剂盒（上海吉玛公司），BCA 蛋白定量试剂盒（上海吉玛公司），SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒（上海吉玛公司），Transwell 小室（武汉普诺赛生命科技有限公司），Ki67 抗体（美国Sigma 公司），增殖细胞核抗原（PCNA）抗体（美国Sigma公司）。

1.3 CRC 组织中miRNA-371-5p 水平的测定取CRC 组织采用miRNA 提取试剂盒提取总RNA，用反转录试剂盒将总RNA 逆转录为cDNA，反应条件为37℃，60 min。将逆转录产物作为模板，利用定量PCR 试剂盒进行PCR 反应，反应条件为95℃15 min，94℃15 s，55℃30 s，72℃30 s，共45 个循环。最后采用PCR 仪检测，miRNA 相对表达量采用2-△△Ct方法，△Ct=CtmiRNA-CtsnRNA[7]。miRNA-371-5p 引物（上游：5'-tgagaactgaattccatgggtt-3'；下游：5'-ATCTACTCTC TCCAGGTCCTCA-3'）和内参基因U6 small nuclear RNA（snRNA）引物（上游：5'-ctcgcttcggcagcagcaca-3'；下游：5'-aacgcttcacgaatttgcgt-3'）。

1.4 miRNA-371-5p 模拟物的转染取SW620 细胞，用LipofectAMINETM2000 试剂盒进行转染，步骤如下：首先制备LipofectAMINETM2000 复合物和DNA 复合物（1 μg/μL 质粒和246 μL 无血清培养基），温室静置20 min。将复合物加入96 孔板，6 h 后更换含血清培养基，温室继续培养48 h。将细胞分为miRNA-NC组（转染对照质粒）和miRNA-371-5p 组（转染miR⁃NA-371-5p模拟物），转染24 h后备用。

1.5 SW620细胞增殖情况克隆形成实验：用胰蛋白酶消化转染后的SW620细胞，接种于96孔板中，37℃、5%CO2条件下培养3周。当出现菌落时停止培养。用4%多聚甲醛进行固定，30 min后用结晶紫染色，在低倍显微镜（×10）下计数大于10 个细胞的克隆数。CCK-8 法：用CCK-8 试剂盒检测细胞活性，细胞培养24、48、72和96 h时，向每个培养孔中添加10 μLCCK-8试剂，最后用酶标仪测定450 nm处的吸光度。

1.6 SW620 细胞侵袭和迁移情况迁移实验：在Transwell 迁移板上室加入5×104个SW620 细胞，下室中加入600 μL 完全培养基，在5%CO2、37℃条件下培养24 h。固定膜底细胞并进行0.1%结晶紫染色20 min，光学显微镜下对SW620 细胞数量进行定量。在侵袭实验中，使用预先加入Matrigel 胶的小室，上室中加入5×104个SW620 细胞，在5%CO2、37℃条件下培养48 h，其余步骤同迁移实验。

1.7 蛋白印迹法检测SW620 细胞增殖相关蛋白Ki67、PCNA 表达水平取用RAPI裂解液提取SW620细胞总蛋白，用BCA 试剂盒检测蛋白浓度，用10%SDS-PAGE 电泳分离蛋白，用半干转移法将蛋白转至PVDF 膜上。随后用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入Ki67抗体（1∶1 000）、PCNA 抗体（1∶500），4℃过夜孵育，次日除去一抗，用TBST 缓冲液洗涤3 次后加入二抗，封闭1 h。ECL 发光仪进行蛋白成像，Image J 软件分析灰度值。

1.8 随访以门诊和电话相结合方法进行随访，随访截止时间为2018 年4 月。随访时间为54～93 个月。获得有效随访135 例，随访率为72.6%。生存时间定义为术后至因CRC 复发、转移或死亡的时间。分析生存预后与CRC 组织miRNA-371-5p 表达水平的关系。分析CRC患者5年生存率的影响因素。

1.9 统计学处理采用SPSS19.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验；生存性分析采用Kaplan-Meier法和Log-Rank检验，采用COX回归模型分析影响患者预后的相关因素，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC 组织和CRC 细胞中miRNA-371-5p 表达量的比较CRC 组织中miRNA-371-5p的相对表达量为（3.8±1.0），癌旁组织中为（8.5±2.8），两组比较差异有统计学意义（t=21.559，P<0.05）。正常人肠上皮细胞HIEC-6 和结肠癌细胞株HT29、SW480、SW620 和HCT116 中miRNA-371-5p 相对表达量分别为（4.35±1.01）、（3.04±0.31）、（1.23±0.13）、（2.56±0.49）、（2.10±0.36），差异有统计学意义（F=9.067，P<0.01），结肠癌各细胞株miRNA-371-5p 相对表达量均低于正常人肠上皮细胞株HIEC，其中SW620表达量最低。

2.2 miRNA-371-5p 表达量与CRC 患者临床病理特征的关系以miRNA-371-5p表达量的中位数为截点，将所有患者分为低表达量组和高表达量组。分化程度低、淋巴结转移和TNM 分期高的患者，miR⁃NA-371-5p表达量越低（P<0.05），见表1。

2.3 miRNA-371-5p 表达量与CRC 患者预后的关系有效随访的135 例CRC 患者5 年生存率为64.4%（87/135）。其中miRNA-371-5p高表达组5年生存率为83.8%（62/74），低表达组为41.0%（25/61），组间比较差异有统计学意义（χ2=6.032，P=0.014）。miRNA-371-5p 高表达组生存时间为（82.6±5.0）个月，低表达组为（59.5±4.2）个月，组间比较差异有统计学意义（χ2=15.011，P<0.01）,见图1。

2.4 影响CRC 患者5 年生存率的相关因素单因素分析表明患者年龄（≥60 岁）、分化程度低、淋巴结转移和miRNA-371-5p 低表达是影响CRC 患者5 年生存率的因素（P<0.05）。多因素分析表明患者年龄、分化程度、淋巴结转移和miRNA-371-5p 表达量是影响患者生存率的独立危险因素（P<0.05），见表2、3。

表3 影响CRC患者5年生存率的多因素Logistic分析

2.5 转染miRNA-371-5p 模拟物对SW620 细胞增殖、侵袭和迁移的影响对SW620 细胞转染miRNA-371-5p 模拟物后，SW620 细胞的增殖活力明显受到抑制（P<0.05），见图2、3。侵袭和迁移力明显受到抑制（P<0.05），见图4、5。Ki67 和PCNA 蛋白表达水平明显降低（P<0.05），见图6、7。

图2 CCK-8法检测转染miRNA-371-5p模拟物对SW620细胞增殖活力的影响

图3 克隆形成实验检测转染miRNA-371-5p模拟物对SW620细胞增殖活力的影响

图4 Transwell实验检测转染miRNA-371-5p模拟物对SW620细胞侵袭力的影响

图5 Transwell实验检测转染miRNA-371-5p模拟物对SW620细胞迁移的影响

图6 蛋白印迹法检测转染miRNA-371-5p模拟物对SW620细胞增殖蛋白Ki67、PCNA表达水平的影响

3 讨论

CRC 是我国常见的消化道肿瘤之一，其发病隐匿，大部分患者发现时已至中晚期，即使手术，5 年生存率也仅为25.0%左右[8]。因此，寻找CRC 特异性标志物显得非常重要。既往研究已证实，miRNA 在肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡等过程中发挥重要作用[9]。miRNA 的异常表达与CRC 的发病和预后密切相关。miRNA-371-5p属于基因间miRNA，具有独立的启动子区域。miRNA-371-5p 在不同肿瘤中发挥的作用也不尽相同。Wang 等[10]发现前列腺癌细胞中miR⁃NA-371-5p 的表达量增加，可抑制瘤细胞的增殖、促进凋亡。Li 等[11]发现miRNA-371-5p 可靶向作用于SOX2 促进瘤细胞的增殖，导致胃癌的发生和进展。miRNA-371-5p 在CRC 中的作用及机制既往报道较少，本研究发现miRNA-371-5p 在CRC 组织和细胞中低表达，上调miRNA-371-5p 后CRC 细胞增殖。侵袭和迁移能力受到抑制，与既往报道类似[12]，提示miRNA-371-5p在CRC中可能发挥抑癌作用。

本研究采用中位数将患者分为miRNA-371-5p高表达量组和低表达量组，结果发现，低表达量组分化程度较低、淋巴结易转移和TNM 分期越高。提示miRNA-371-5p 可能于CRC 的分化和远处转移等有关。本组研究中，135 例CRC 患者5 年生存率为64.4%（87/135），这与Miao 等研究一致[13]。影响CRC患者预后的因素有很多，而且非常复杂，但是公认的有年龄、分化程度、肿瘤分期、远处转移、免疫状态、复发等[14-17]。本研究采用Logistic 多因素模型进行分析，发现年龄（≥60 岁）、分化程度低、淋巴结转移是影响CRC 患者5 年生存的独立危险因素，这与张卫刚等[18]的研究结果一致。陈香浏等[19]检测了50 例结直肠癌患者血清中miRNA-21、miRNA-371-5p 和miR⁃NA-378 的表达水平，发现miRNA-371-5p 和miR⁃NA-21 与肿瘤复发和预后明显相关，本研究结果与之类似。本研究中，miRNA-371-5p 高表达组5 年生存率为83.8%（62/74），明显高于低表达组为（41.0%），这就提示miRNA-371-5p 可能作为预后CRC患者术后生存时间的标记物。

综上所述miRNA-371-5p 在CRC 组织中低表达，与生存预后有关。上调miRNA-371-5p 可抑制CRC 细胞增殖、侵袭和迁移。本研究也存在一些局限性，例如未检测外周血中miRNA-371-5p的表达水平，未检测miRNA-371-5p下游靶基因的表达。未来需要进一步进行机制研究，深入分析miRNA-371-5p在CRC中的作用机制。