琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂吡噻菌胺的研究进展

刘超，田庆恒

（1.山东省青岛清源化合物有限公司 青岛市 266000；2.海南大学 海口市 570100）

琥珀酸脱氢酶抑制剂（Succinate Dehydrogenase Inhibitors，SDHI）是继甲氧基丙烯酸酯类和三唑类之后的第三大类杀菌剂，是可通过抑制病原菌琥珀酸到泛醌的电子传递，阻断能量代谢，最终导致病原菌死亡的新型酰胺类杀菌剂[1]。SDHI 类杀菌剂大都具有广谱性，对多种作物上的白粉病菌、菌核病菌和锈病菌等多种病菌都有良好的生物活性。自1966 年美国Uniroyal（现朗盛）公司研发地第一个SDHI类杀菌剂萎锈灵（carboxin）开始，具有广谱性的SDHI 类杀菌剂相继被开发并进入全球市场[2]。2016 年，SDHI 杀菌剂的市场销售额近17 亿美元，占全球农药市场的3.0%，并以23.8%的复合增长率超过了传统的甲氧基丙烯酸酯类和三唑类等类型的杀菌剂，成为最有前景的杀菌剂类型[3]。

吡噻菌胺（penthiopyrad）是1996 年由日本三井化学株式会社开发的琥珀酸脱氢酶抑制剂[4-5]。与其他的SDHI类杀菌剂一样，吡噻菌胺也是作用于病原物的线粒体，通过抑制琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase,SDH），使得病原菌的三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle）产生障碍，阻碍生物体的能量代谢，影响病原物的正常生长，最终导致病原物死亡。其化学名称为（RS）-N-[2-（1，3-二甲基丁基）-3-噻吩基]-甲基-3-（三氟甲基）-1H-吡唑-4-甲酰胺，分子式为C16H20F3N3OS，相对分子量为359.42，美国化学文摘登记号（CAS，Chemical Abstracts Service）为183675-82-3，化学结构式见图1。外观为白色结晶固体，纯品熔点103 ℃~105 ℃，降解点381.3 ℃，熔沸点较高，自然状态下较稳定；20 ℃下水中溶解度为7.53 mg/L，水溶性低；常见有机溶剂甲醇、丙酮、乙酸乙酯和甲苯的溶解度分别为402 g/L、410 g/L、349 g/L、67 g/L。研究表明吡噻菌胺对哺乳动物安全且无致癌、致突变的风险，对人畜安全[6]。目前，吡噻菌胺已经在包括中国在内的多个国家进行登记使用，应用前景广阔。

图1 吡噻菌胺的化学结构式

本文结合国内外吡噻菌胺的相关研究进展，对其合成工艺、生物活性、生态毒性、环境行为和农药抗性研究5个方面对吡噻菌胺进行综述，旨在为其农业合理应用、科学有效管理与生态风险规避提供理论支撑。

1 吡噻菌胺合成工艺研究

国内外关于吡噻菌胺的合成方法主要有两种：合成路线Ⅰ是中间体1-甲基-3-三氟甲基-1H-吡唑-4-甲酰氯和中间体2-（4-甲基戊基-2-）-3-氨基噻吩反应生成吡噻菌胺[7]，该研究中的合成工艺路线总产率为45.3%，纯度为98.8%（HPLC）；合成路线Ⅱ是中间体N-（3-噻盼）-1-甲基-3-三氟甲基-1H-吡唑-4-甲酰氯，与甲基异丁基甲酮反应后还原双键得到吡噻菌胺[8]。两种合成路径都需要中间体1-甲基-3-三氟甲基-1H-吡唑-4-甲酰氯的参与，而该中间体目前共有6 条合成路线[9-14]，其中以三氟乙酰乙酸乙酯的合成路线工艺最简单，具有原料易得到、反应条件相对温和等特点，比较适合工业化生产[15]。中间体2-（4-甲基戊基-2-基）-3-氨基噻吩的合成以3-氨基噻吩-2-甲酸甲酯为原料，经氨基保护、水解、脱羧后与甲基异丁基甲酮反应，经催化加氢、脱氨基步骤后得到[8]。

通过生物合成取代苯基-5-三氟甲基-1h-吡唑-4-羧酰胺所得到的吡噻菌胺的衍生物也有报道，这些衍生物相较于吡噻菌胺在某些病菌的防治效果上更具潜力；如在赤霉病菌、尖孢镰刀菌、水曲霉和疫霉菌的防效试验中，抑菌活性更强[16]。

2 吡噻菌胺的生物活性

生物活性是评价吡噻菌胺杀菌功效的关键。吡噻菌胺对锈病、菌核病、灰霉病、白粉病等多种病菌的孢子萌发和菌丝生长都具有明显的抑制作用，近期发现在炭疽病的防治领域也有很好的应用前景[17]。相较于传统的SDHI 类杀菌剂，吡噻菌胺具有更强的渗透和内吸性，还可以提供预防和治疗的作用，可以防治蔬菜水果、观赏作物和经济作物等多种作物上的多种真菌病害[18]。吡噻菌胺分子中含有酰胺和吡唑2种高活性基团，这一点是使它区别于早期开发出来的单纯的酰胺类杀菌剂，具有更强杀菌活性的根本原因[19]，日本和法国的大田试验表明，叶面施用吡噻菌胺可以很好地防治苹果黑星病（药效与醚菌酯相当，优于代森锰锌）、苹果白粉病（药效与己唑醇相当，略逊于醚菌酯）、黄瓜灰霉病（药效与异菌脲相当）和黄瓜白粉病（药效优于四氟醚唑）[20]。通过大田试验研究不同稀释倍数的20%吡噻菌胺悬浮剂防治葡萄灰霉病的试验结果表明，1 500 倍稀释液对葡萄灰霉病的防治效果最好，为85.14%，显著优于稀释2 000 和2 500 倍液的防效（分别为65.21%和52.93%）[21]。橡胶炭疽病菌中吡噻菌胺的室内毒力测定结果显示：吡噻菌胺对炭疽病菌的半数效应浓度（EC50）值为1.685 mg/L。吡噻菌胺的使用导致橡胶炭疽病菌ATP 含量下降，影响了病菌分生孢子萌发和附着胞形成，从而提高了细胞膜的通透性，降低了菌丝数量，抑制了病菌生长。进一步的大田防效生测结果表明：吡噻菌胺对橡胶炭疽病的防治效率可达98.53%[22]。吡噻菌胺在用于防治草莓的炭疽病时，其平均EC50为2.09 μg/mL，且其他SDHI 类杀菌剂均无此药效[23]，也进一步说明吡噻菌胺防效优异，是其他SDHI类杀菌剂的优秀替代品。

吡噻菌胺对核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）也有很好的防治效果，通过试验证实：吡噻菌胺平均EC50值为0.0578 μg/mL，经吡噻菌胺处理后的核盘菌菌株的菌丝体顶端分枝增加且更密集，细胞膜通透性显着增加。此外，菌丝中的甘油含量、草酸（OA）和胞外多糖（EPS）含量显著下降，菌丝呼吸受到明显抑制[24]。吡噻菌胺与其他类的农药的复配使用也具有很好的生物活性，不仅可以延缓病原物抗性的产生，还可以扩大杀菌谱。

吡噻菌胺的复配产品较多，美国杜邦公司所开发的吡噻菌胺与百菌清的复配产品Treoris、日本曹达公司开发的啶虫脒和吡噻菌胺复配产品Mytemin 等都早已进入市场且都具有较强的市场竞争力，吡噻菌胺与吡唑醚菌酯或环唑醇的复配产品更是作为美国东南部花生早期叶斑病（Passalora arachidicola）和晚期叶斑病（Nothopassalora personata）防治的首选杀菌剂，在具有较好防效的同时，还提高了经济效益[25]。

3 吡噻菌胺的生态毒性

对非靶标生物的生态毒性是评价吡噻菌胺风险等级的重要指标。通过急性和慢性毒性研究研究结果可得知，吡噻菌胺通过环境中的一些途径进入生物体时，不仅会对一些包括鱼类和虫体在内的非靶向生物体产生毒性，还可能给暴露于环境中的生物体（包括人类）带来有害健康的风险，吡噻菌胺在进入非靶向生物体内时会产生一些潜在的毒性，特别是对神经发育具有重要的影响[26]。蜜蜂的吡噻菌胺日允许摄入量（ADI）为100 μg/kg.bw，通过一项试验结果表明，花期施用吡噻菌胺时，杀菌剂会通过花粉被蜜蜂等传粉昆虫携带而对幼虫产生影响，蜜蜂幼虫中多次检测到吡噻菌胺的存在，其中最高的检测量达到了115.3mg/kg[27]，而神经毒性的杀菌剂经常被怀疑会对蜜蜂的学习和导航能力产生干扰和毒害作用，故吡噻菌胺的使用可能会对蜜蜂等携粉昆虫产生影响[28]。吡噻菌胺对哺乳动物的风险较低。日本将普通人群吡噻菌胺可接受的每日摄入量（ADI）为0.081 mg/kg.bw。通过大鼠的急性毒性测试结果发现，吡噻菌胺对大鼠的急性经口LD50>2 000 mg/L，急性经皮LD50>2 000 mg/L，急性吸入LD50>5 669 mg/L 除对兔眼睛有轻微刺激作用外，对兔皮肤无刺激性和致敏性[29]，对大鼠和兔均无致癌性、无致突变性。吡噻菌胺的使用可以通过地表径流、雨水或灌溉等途径进入水体环境，对水生生物的安全产生影响。大量研究表明，吡噻菌胺对水生生物的急性毒性较高，且对淡水鱼有剧毒，对肥头鲦鱼、虹鳟鱼和鲤鱼的96 h 的LC50分别为290 mg/L、386 mg/L和572 mg/L。一些水生生物如水蚤24 h 的LC50为40 mg/L，水藻72 h的EC50为2.72 mg/L[30]。通过对吡噻菌胺的斑马鱼胚胎和仔鱼的急性毒性试验，吡噻菌胺会影响斑马鱼仔鱼的脂质代谢从而导致一系列的畸变作用，且会影响幼鱼的生命活动导致死亡[31]。

4 吡噻菌胺的环境行为

痕量追踪生态环境介质中吡噻菌胺及其代谢物，是对其进行生态环境安全评价的基础。农药的降解是农药学领域的研究重点，与农药的残留紧密相关，每一种农药的残留检测与控制又是农药残留领域的研究重点，农药的化学结构组成和环境条件都会对残留消解产生影响。农药的光解作用是大气、水体中或植物体表面上的农药在光诱导下进行的一种非常重要的非生物降解途径，对农药的残留、毒性或者是药效都会产生特别重要的影响。吡噻菌胺的光稳定性较强，无法进行光解。作物种类的不同也会对吡噻菌胺的残留量产生影响，如叶片表面覆盖有很多纤毛，或植株上覆盖有很多毛状茎的作物，农药的残留水平往往比那些表面光滑的作物相对较高。作物的生长速度的快慢也会影响农药残留量的检测值。

吡噻菌胺作为典型的手性农药，其分子结构中存在一对互为实物与镜像的对映异构体。对映异构体之间虽然可能存在相似的理化性质，但是它们的光学性质和生物活性在不同的生物中可能截然不同，其生物富集和环境行为之间也会差异较大。所以，对吡噻菌胺的立体选择性环境行为进行研究，对吡噻菌胺环境安全的评估、农药的残留都有着重要的理论和实际意义[6]。目前所报道的吡噻菌胺在植物源和动物源的残留分析方法主要为液相色谱串联质谱分析[32]。相关报道所建立的吡噻菌胺对映体高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析方法，各土壤环境下吡噻菌胺的对映异构体在不同土壤中的降解趋势符合一级动力学规律，存在立体选择性降解行为。不同pH值的土壤环境中吡噻菌胺的降解速率存在显著差异（P<0.05）：吡噻菌胺外消旋体在酸性土壤中，降解半衰期为36.7～58.7 d；在近中性土壤中的半衰期为42.1～59.8 d；在碱性土壤中降解的半衰期为48.3～59.6 d。而在灭菌条件下3种pH值不同的土壤中，其降解均不超过15%，土壤中有机质和土壤微生物类群的不同对吡噻菌胺的土壤降解影响较大。不同土壤条件下吡噻菌胺单体构稳定，均未发现吡噻菌胺对映体之间相互转化[33]。

5 吡噻菌胺的抗性研究

单一农药的连续使用，会导致靶标生物产生抗药性，而对抗药性进行研究可以更好地了解吡噻菌胺是否还能够能作为持续使用的杀菌剂种类，由于靶标的作用位点单一[34]，杀菌剂抗性行动委员会 （Fungicides Resistance Action Committee，FRAC）将SDHI 杀菌剂归为中等至高抗性风险，并开展了一系列的抗性监测工作[19]，且不同研究方法都已经检测到多个靶标位点的突变。自最早于2007年报道的美国加州开心果园的黑斑病 （Alternariaalternata）分离物对啶酰菌胺产生抗性开始[35]，目前已有十多种病原菌对SDHI 杀菌剂存在抗性，吡噻菌胺作为琥珀酸脱氢酶的酰胺类杀菌剂一员，关于抗性的报道也较为广泛。

SDHI 杀真菌剂是草莓和其他作物灰霉病防治的重要手段，通过跨越3个季节对美国东部的草莓田中灰霉病菌检测发现，抗吡噻菌胺的灰霉病菌株总数在3 个季度内增加了7.4%。并对具体的突变体基因型的抗药性进行了报道：SdhB 亚基的突变体中突变频率分别为0.5%、2.5%和4%的BH272L、BP225F和BN230I3 种突变体对吡噻菌胺具有较高的抗性，且与其他SDHI杀菌剂也产生了交互抗性。另外，吡噻菌胺致病亚基的突变体相较于普通灰霉病菌株具有更强的生存和与野生动物竞争的潜力[36]。而在西班牙草莓灰霉病抗性研究进展中发现，灰霉菌对啶酰菌胺和吡噻菌胺的联合抗性为13.8%，由于H272R和H272Y相关位点氨基酸表达的影响，并未发现具有高抗性的变异基因型，敏感度高[37]。

链格孢属（AlternariaNees）是全球分布最广、具有重要经济作用的半知菌类真菌之一，其95%以上的种类兼性寄生于植物上，引起多种植物病害，造成全球性的田间和产后巨大的经济损失，通过吡噻菌胺控制病害并延缓抗药性的产生一直是农业生产中的巨大难题：在美国爱达荷州马铃薯田中早疫病所属的链格孢属菌种的抗性研究进展中发现，57%的分离样本对吡噻菌胺产生了耐药性，且对一些新的SDH 抑制剂产生了交互抗性[38]。同样，在美国密歇根州的敏感性试验中发现，2011—2012 年2 a 间，21%的筛选菌株对吡噻菌胺产生了中度抗性，11%的筛选菌株对吡噻菌胺产生了高度抗性，而这些具有抗性的分离株均含有H133R突变基因，且和一些同类的SDHI杀菌剂也产生了交互抗性[39]。而在美国中西部地区，在对同属链格孢属的番茄早疫病菌对吡噻菌胺的抗性研究中发现：吡噻菌胺对番茄早疫病的链格孢菌的平均EC50为0.38 μg/mL，仍具有较高的敏感性[40]。在对桃样本中链格孢属对吡噻菌胺具有高抗性的基因型研究中发现：SDHB 的H277Y/R和SDHC的H134R突变型，还有G87位点的突变体，都对吡噻菌胺具有高度抗性，H134R和D123E位点的突变体使吡噻菌胺的EC50值提高了50%[41]。

黑星病菌（Cladosporium）作为瓜果上常见的真菌性病害，近年来在大棚的瓜果种植中发病越发严重，而吡噻菌胺常作为防治黑星病菌的常用药剂在大田中施用，其抗药性相关方面的报道也较为广泛：在美国苹果黑星病防治过程中，吡噻菌胺对黑星病菌的平均EC50值为0.086 μg/mL，在不同的生长阶段均具有较好的防治效果，且未发现抗性菌种，敏感度高[34]。而在黄瓜黑星病菌抗性研究中发现，SdhC位点上的S73P、SDHB位点上的1280V和H278R变异对吡噻菌胺具有低等抗性，SDHB 位点上的H278Y和SDHD 位点上的D95E变异对吡噻菌胺具有中等抗性，SDHD 位点上的H105R和G109V变异对吡噻菌胺具有高抗性[42]。

其他类型的真菌性病害的抗药性现状也有相关报道。如在葡萄白粉病菌抗性研究中，SDHB基因位点突变导致氨基酸H267Y被取代或携带SDHC（G91R或G150R）突变的分离株都对吡噻菌胺具有高抗性[43]。在甜瓜蔓枯病菌研究中发现，BVHR基因突变菌株对吡噻菌胺具有较强耐药性[44]。

6 问题与展望

作为新型的SDHI，吡噻菌胺在弥补传统的SDHI日益增长的抗药性和环境问题的同时，具有更广泛的杀菌谱，并在世界上的多个国家获得了登记使用，应用前景广阔。吡噻菌胺做为具有手性的SDHI类杀菌剂，在实际的生产生活中对映体之间虽然可能具有相似的理化性质，但在不同的受体环境中可能表现出较大的活性、毒性等方面的差异，目前虽已有研究通过超高效液相色谱串联质谱开发了吡噻菌胺对映体的检测方法，对映体层面选择性生物活性、生态毒性以及环境行为的差异相关方面的研究却鲜有研究，因此，从对映体方面对吡噻菌胺的立体选择性差异进行研究将是未来研究的重点。