新型酞菁类光敏剂的合成及其在光动力学抗菌化学疗法中的应用

刘晓龙，赵 鑫

（1. 延安大学医学院，陕西 延安 716000；2. 锦州医科大学医疗学院，辽宁 锦州 121000）

自1942年青霉素投入使用以来，人类就进入了抗生素治疗细菌感染的时代［1］。然而抗生素的滥用导致耐药细菌广泛流行，特别是临床常见的革兰氏阳性耐药菌，如肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）［2-3］、耐万古霉素肠球菌（vancomycin-resistant enterococcus，VRE）［4］和 耐 青 霉素肺炎链球菌（penicillin-resistant streptococcus pneumoniae，PRSP）［5-7］等。

光动力学疗法（photodynamic therapy，PDT）是光敏剂（photosensitizers，PS）在适当波长的光照下，产生对靶细胞有毒的单线态氧（1O2）（图1），杀死靶细胞的一种治疗方法。光动力学抗菌化学疗法（photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT）是PDT 的衍生疗法，其对敏感细菌和耐药细菌的灭活显示出极大潜力［8-10］。迄今为止，PACT 已被证明对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均有灭活效果［11-14］，且细菌很难对活性氧或自由基产生耐药［15-16］。光敏剂作为PDT/PACT 中的关键材料，要求其具有独特的结构。近年来，已有以四吡咯为核心的卟啉、卟吩、酞菁等化合物作为PS的研究［17-19］。特别是酞菁（phthalocyanine，PC）化合物，由于其独特的芳香结构使其在经600～800 nm［20-21］波长的光照后能高效率地产生1O2，被认为是一种优良的光敏剂。然而PCs在大多数溶剂中的低溶解性和易发生聚合等缺点，严重地影响菌体内单线态氧的产生效率和利用率，最终使其在PACT 中的使用受到限制。因此，本文通过增加水溶性取代基合成了4 个酞菁化合物，并针对Klebsiella pneumoniae、VRE 和MRSA 3种耐药菌进行PACT和最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）实验。

图1 PACT过程中的能量转移示意图

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

所有化学试剂购自西格玛-奥德里奇公司，且无需进一步纯化。肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌3 种耐药菌均来自于西京医院。细菌菌株的培养采用从OXOID Luria-Bertani（LB）培养基和Mueller-Hinton（MH）肉汤。四甲基硅烷（Tetramethyl silane，TMS）作为内标，并在INOVA400 液体超导核磁共振谱仪（瓦里安，美国）上以400 MHz 记录1H NMR 光谱。在UV8453 光谱仪（安捷伦，美国）上记录UV-可见吸收光谱。使用Vario ELⅢ元素分析仪进行元素分析。在微型TOF-Q（布鲁克）质谱仪上获得高分辨质谱（High Resolution Mass Spectrometry，HRMS）结果。

1.2 有机合成

酞菁化合物6-9的合成按图2所示路线进行。

1.2.1 中间体合成过程

1.2.1.1 邻苯二甲酰亚胺（1）的合成 邻苯二甲酸酐（5 g，33.7 mmol）、尿素（2.45 g，40.8 mmol）于研钵中，混合研细后加入到提前预热好的100 mL三颈瓶中，搅拌下缓慢加热到140℃，混合物逐渐变成熔融态，并有大量气体放出，且瓶颈上有白色针状晶体析出，随后反应体系体积突然增加到原来体积的3 倍，立即给烧瓶中加入40 g 水，冷却后抽滤，水重结晶，抽滤，干燥。

1.2.1.2 4-硝基邻苯二甲酰亚胺（2）的合成 10 mL浓硫酸于50 mL 双颈瓶中，搅拌下加入3.6 mL 浓硝酸，冰浴条件。待体系温度低于12℃后，并保持温度在12～15℃，缓慢加入1（2 g，13.6 mmol），加完后撤去冰浴，室温反应，反应液逐渐由无色变为黄色浑浊液。3 h后升温至55℃，反应0.5 h，溶液由浑浊变澄清。将上述溶液冷却到40℃以下后缓慢倒入45 g冰中，立即有大量黄色固体析出，冷却，抽滤，收集滤液，干燥，乙醇重结晶，滤去不溶物，冷却，抽滤。

1.2.1.3 4-硝基邻苯二甲酰胺（3）的合成 称取2.4 g（12.5 mmol）4-硝基邻苯二甲酰亚胺于50 mL圆底烧瓶中，加入12 mL 浓氨水，室温反应3 h。待反应结束后，抽滤，5%氨水洗涤，干燥。

1.2.1.4 4-硝基邻苯二甲腈（4）的合成 量取10 mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺（N，N-Dimethylformamide，DMF）于50 mL 双颈瓶中，冰盐浴条件下用恒压漏斗滴加370 μL 氯化亚砜，滴加完毕后，继续搅拌10 min后，分次加入对硝基邻苯二甲酰胺0.5 g（2.4 mmol），以上步骤保证温度在5℃以下，继续搅拌45 min 后升至室温继续反应2 h 得浅黄色透明溶液。将上述溶液倒入6 g 冰中立即有米黄色固体析出，冷却，抽滤，5%的碳酸钠溶液洗涤，干燥。

图2 酞菁化合物的合成路线

1.2.1.5 中间体5的合成 称取1.18 g（8.55 mmol）4-硝基邻苯二甲腈，于50 mL 双颈瓶中，加入15 mL干燥的二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），完全溶解得到粉红色溶液，搅拌下将1.18 g（8.6 mmol）对羟基苯甲酸和1.75 g（12.5 mmol）碳酸钾倒入烧瓶中，氮气保护下反应，4 h 和24 h 后分别再次加入1.75 g（12.5 mmol）碳酸钾。随反应的进行体系颜色逐渐变为棕红色，橘黄色，反应两天后，薄层色谱法监测并与两种原料对比发现有新物质产生，继续反应1 d。待反应停止后将溶液加入300 mL 水中，有米黄色黏稠状固体析出，浓盐酸调pH 值到1，冷却，抽滤，少量水洗涤，干燥。

1.2.2 酞菁化合物6-9的合成过程

1.2.2.1 对羟基苯甲酸取代酞菁（6）的合成 称取480 mg（1.81 mmol）化合物5，35 mL 干燥的正戊醇，1 mL 1,8-二偶氮杂双螺环［5.4.0］十一-7-烯于100 mL 双颈瓶中，160℃回流，氮气保护。10 h后停止反应，将溶液倒入90 mL 甲醇∶水=1∶3 的溶液中，有黑色固体絮状物析出，静置，抽滤，乙醇、甲醇、丙酮、水分别洗涤两次直到滤液为无色且pH 为中性，干燥。

1.2.2.2 四硝基取代镍酞菁（7）的合成 取200 mg（1.16 mmol）化合物4 和74.2 mg（0.34 mmol）三氯化镍，20 mL 无水乙醇于50 mL 烧瓶，升温至160℃回流3 h，停止反应，冷却至室温，抽滤，乙醇、甲醇、丙酮、水分别洗涤两次直到滤液为无色且pH 为中性干燥，得蓝绿色固体115.9 mg。将所得产物用N,N-二甲基甲酰胺和无水乙醚两种溶重结晶，抽滤。

1.2.2.3 四硝基取代酞菁（8）的合成 称取173.13 mg（1 mmol）化合物4于100 mL双颈瓶中，加入30 mL 干燥的正戊醇，搅拌下加入1 mL 的1,8-二偶氮杂双螺环［5.4.0］十一-7-烯，氮气保护，160℃回流10 h。反应体系逐渐由无色溶液变为棕绿色直到黑色溶液。反应停止，冷却至室温后将反应液倒入5 mL 甲醇∶水=1∶3 的溶液中搅拌后有黑色固体析出，静置，溶液分层，上层是黑色，下层为棕黄色，抽滤得黑色固体，用乙醇、甲醇、丙酮、水分别洗涤直到滤液为中性。

1.2.2.4 四氨基取代酞菁（9）的合成 称取250 mg（0.33 mmol）化合物8，1.25 g 硫化钠于50 mL 烧瓶中，加入20 mL H2O，50℃下回流5 h。反应停止后，过滤，用盐酸（0.5 mmol/L），氢氧化钠（1.0 mmol/L）溶液反复洗涤3次，再用水洗至中性，70℃烘干。

1.3 抗菌活性评价

1.3.1 MIC 的测定 MIC 的测定选用常量肉汤稀释法，参照美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的具体操作方法［22］。以化合物6-9 作为抑菌药物，对肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌三种细菌进行MIC 评价。将固体Luriae-Bertani（LB）平板上的上述细菌单菌落转移到10 mL Muellere-Hinton（MH）培养基中，在35℃下培养2～6 h，获得108CFU/mL 菌液。准备750 μg/mL 的化合物6-9的二甲基亚砜溶液，将制备的6-9溶液用MH培养基稀释至1 mL，使每管中化合物6-9 的浓度分别 为375 μg/mL、187 μg/mL、93 μg/mL、46 μg/mL、23 μg/mL、12 μg/mL、6 μg/mL、3 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL和0.5 μg/mL。1 mL细菌培养物依次添加到制备的溶液中，然后将混合物在37℃下孵育24 h，观察化合物的灭菌效果。

1.3.2 化合物6-9 的PACT 实验 PACT 实验根据文献所述方法进行［23］。37℃下挑取肺炎克雷伯菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌的单克隆体在20 mL 液体LB 培养基中过夜培养。4°C 下离心（4000 rpm，10 min）收集菌斑，用0.01 M的PBS 清洗3～6 次，稀释至O.D.600=0.5。准备浓度分别为4 μM，8 μM，12 μM，16 μM，20 μM 的化合物6-9 溶液。取0.5 mL 不同浓度的样品与0.5 mL的菌液混合在37℃的条件下孵育30 min，用400-800 nm的氙灯光源（350 mW）照射3 min，总光剂量为35 J/cm2。光源照射后的样品再离心（4°C，4 000 rpm，10 min），弃去上清液，用0.01 M 的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）重悬两次后，用0.01 M的PBS 稀释2.5×103倍，取15 μL 均匀涂布在LB 固体培养基上，37℃下在恒温培养箱中过夜培养，计算生长出的单克隆体的个数，以未光照的样品为空白，计算样品对这3种菌的光动力学灭活率，为了便于误差分析，每个实验重复3遍。

2 结果

2.1 化合物4-9的表征结果

化合物4（产率：55.4%）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 8.56-8.58（d，1H），8.28（s，1H），8.19-8.22（d，1H）。

化合物5（产率：43.4%，米黄色固体）。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 8.15-8.17（d，2H），7.77-7.79（d，1H），7.36（s，1H），7.29-7.31（d，1H），7.13-7.15（d，2H）。

化合物6（产率：47%，蓝黑色固体）。元素分析：C32H22N12▪8.2H2O，理论值：碳（C），54.43%；氢（H），3.12%；氮（N），23.82%。实际值：碳（C），54.35%；氢（H），3.12%；氮（N），23.73%。UV-vis（DMF，λmax，nm）：606，637，663，666，699。HRMS（ESI）理论值：C60H33N18O12［M-H］-1057.2220，实际值：1057.1988。

化合物7（产率：49%，墨绿色固体）。元素分析：C32H22N12Ni▪6.2H2O，理论值：碳，62.20%；氢，4.00%；氮，11.05%。实际值：碳，60.15%；氢，3.82%；氮，11.13%。UV-vis（DMF，λmax，nm）：636，671。 HRMS（ESI）理 论 值C32H13N12O8Ni［M+H］+708.1134，实际值：708.1202。

化合物8（产率：36.74%，黑色固体）。元素分析：C32H14N12O8▪5.6H2O，理论值：碳（C），56.48%；氢（H），3.15%；氮（N），21.18%。实际值：碳（C），56.35%；氢（H），3.22%；氮（N），21.35%。UV-vis（DMF，λmax，nm）：661，728。HRMS（ESI）理论值：C32H14N12O8［M+H］+695.1134，实际值：695.1189。

化合物9（产率：60%，黑色固体）。元素分析：C32H22N12▪8.2H2O，理论值：碳（C），氢（H）3.12%；氮（N）%。实际值：碳（C），54.35%；氢（H），3.12%；氮（N），23.73%。UV-vis（DMF，λmax，nm）：661，732。HRMS（ESI）理论值：C60H33N18O12［M+H］+575.2166，实际值：575.2102。

元素分析结果、紫外数据及高分辨质谱可得化合物4-9的结构为图2中的目标结构。

2.2 MIC结果

化合物6-9 对肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌的MIC 结果如表1所示。从表中结果可以看出，化合物6-9 对所有的测试菌的MIC 值均大于128 μg/mL，表明化合物6-9本身不能灭活3种测试菌。

表1 化合物6-9的MIC值（μg/mL）

2.3 光动力学灭菌结果

从化合物6-9 的MIC 结果可以看出所有化合物对三种耐药细菌均无灭活作用。在进一步的PACT 实验中我们依然选用肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌这3 种耐药菌作为待测菌株。针对不同浓度化合物6-9的光动力灭菌效果见图3。图3 中的结果显示随着化合物6-9 浓度的增加，这4 种化合物对3 种耐药细菌的光灭活作用均增强，表明化合物6-9 的光灭活作用均呈剂量依赖性。特别是化合物6，当其浓度为4 μmol/L 时，对3 种耐药菌的灭活率约80%，当浓度为6 μmol/L 时对三种耐药细菌的灭活率均超过90%（图3A）；对硝基取代的镍酞菁7 而言，其浓度为10 μmol/L 时对Klebsiella pneumoniae 和VRE的灭活率约50%，而对MRSA 的灭活率仅为20%（图3B）；化合物8 虽然对3 种耐药菌都有一定的灭活效果，但对3 种菌的光灭活作用均很弱（10 μmol/L 时的灭菌率低于40%，图3C）；氨基取代的酞菁化合物9 显示出与化合物7 相似的光灭活效果，其在10 μmol/L 下 对MRSA 的 灭 活 率 超 过40%，而 对VRE 和MRSA 两种耐药菌的灭活率不到40%（图3D）。

图3 化合物6-9的光动力学灭菌结果

3 讨论

PACT 作为一种能有效灭活耐药细菌的方法，其光敏剂的选择意义重大。本研究中通过有机合成的方法合成了4 种酞菁类化合物（6-9），并将这4种酞菁化合物作为光敏剂测试了其对肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌这3种耐药细菌的MIC值和光动力灭菌效果。实验结果表明化合物6-9 对3 种耐药菌的MIC 值均＞128 μg/mL，表明化合物本身对3 种细菌均无灭活作用；PACT 实验结果表明，化合物6-9 分别对3 种耐药菌有一定程度的灭活作用，特别是苯甲酸取代的化合物6，随其浓度的升高，光动力灭菌效果增强，当其浓度为6 μmol/L 时对3 种耐药细菌的灭活率均超过90%，显示出优秀的光动力灭菌效果。上述结果表明，酞菁化合物是一类优秀的光敏剂，且通过增加酞菁化合物的溶解度可有效提高其光动力灭菌效果。