三种胡枝子对干旱胁迫的生理响应

刘建勇，王照兰，杜建材，张颖娟，3

（1.内蒙古师范大学 生命科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特 010022；2.中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010；3.内蒙古师范大学 学报编辑部，内蒙古 呼和浩特 010022）

胡枝子属（Lespedeza）植物，为豆科（Leguminosae）重要的野生牧草种质资源，全世界有60 余种，我国26 种［1］，属多年生草本状半灌木或灌木。其根系发达，抗干旱、寒冷，耐贫瘠，生态适应性强，广泛分布于沙石地、丘陵水土流失严重地带及退化沙化草地等，在我国北方地区水土保持、退化沙化草地植被恢复、荒漠化防治中具有重要的开发利用潜力［2］。但是，与紫花苜蓿（Medicago sativa）、三叶草（Trifolium repens）、锦鸡儿（Caragana sinica）等其他豆科牧草相比，对胡枝子属植物的研究和利用相对滞后，培育出的胡枝子品种较少［3］。

随着国家生态治理和荒漠化防止政策的实施，胡枝子属植物的重要价值，引起了许多学者的关注。黄瑾等［4］研究了达乌里胡枝子在黄土丘陵区的生产力及土壤水分。赵国靖等［5］揭示了达乌里胡枝子根系形态特征对土壤水分变化的响应。薛菲等［6］开展了胡枝子对盐碱胁迫的生理响应。有关尖叶胡枝子（Lespedeza hedysaroides）、牛枝子（Lespedeza potaninii）和达乌里胡枝子（Lespedeza davurica）3 个物种抗旱机理的研究报道尚少。

尖叶胡枝子（L.hedysaroides）为小灌木，主要分布于我国东北及华北，是华北地区山地天然草地中最常见的豆科牧草之一［1］。牛枝子（L.potaninii）为半灌木，分布于我国华北、西北、华中等多个省区，生长于荒漠草原、草原带的沙质地、丘陵地、砾石地、石质山坡及山麓，耐干旱，可作水土保持及固沙植物［1］。达乌里胡枝子（L.davurica）为草本状半灌木，主要分布在我国东北、华北、西北、华中至云南，生长于森林草原和草原地带的干山坡，丘陵坡地、沙质地，为草原群落的次优势成分或伴生成分，耐旱耐瘠薄，适于放牧或刈割，也可作为山地、丘陵地及沙化草地的水土保持植物［1］。

本实验测定上述3 种植物在干旱胁迫条件下的生理指标，了解3 种植物的抗旱机理，旨在探讨其抗旱生理变化特征，为开展其转录组研究、新品种培育以及在干旱条件下的种植利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究材料

研究材料为课题组通过前期研究培育出的尖叶胡枝子、牛枝子和达乌里胡枝子，均来自中国农业科学院草原研究所。

1.2 试验设计

1.2.1 种子处理 选取上述3 种胡枝子粒大饱满的成熟种子（果实），分别用砂纸进行打磨，去除其果皮并破除其种子硬实性（通过预备试验，确保打磨后的种子发芽率达75% 以上）。将打磨好的干净种子，按不同种分别放入盛有75% 乙醇的烧杯中，灭菌处理3 min 后，倒出75% 乙醇，加入蒸馏水，快速冲洗多次。之后分别取出各种子，置于多层干滤纸上，风干待用。

1.2.2 发芽试验 在15 cm 口径的培养皿中，铺两层滤纸，将上述处理好的种子置于滤纸上，每个培养皿200 粒种子，每种胡枝子50 个培养皿。之后，将培养皿放入植物培养箱进行发芽（温度25 ℃，光强5 500 lx，光/黑=12 h/12 h）。发芽24 d 后，倒出培养皿中的水，再向各培养皿中加入15%PEG‐6000 溶液，进行模拟干旱胁迫处理。在胁迫的0 h（对照）、6.5 h、13 h、19.5 h、26 h，依次取各种胡枝子的幼苗（包括根和叶），测定RWC（相对含水量）、REC（相对电导率）、SOD（超氧化物歧化酶）活性和MDA（丙二醛）含量，每种胡枝子的4 个指标在各个处理时间点，均设3 次重复。

1.3 测试方法

相对含水量测定采用了饱和称量法；质膜透性测定采用了相对电导率法；丙二醛含量测定采用了硫代巴比妥酸法［7］。超氧化物歧化酶测定使用上海生物科技有限公司试剂盒进行测定，具体方法采用分光光度法（具体操作略有改动），即首先将各个处理梯度的胡枝子幼苗样品（约0.15 g），从-80 ℃超低温冰箱取出，置于预冷好的研钵，加液氮快速研磨好后，转入提前预冷好的离2.5 mL 心管，之后加入1 mL 提取液，充分震荡均匀。在8 000 r/min 离心机离心10 min，温度保持4 ℃，取上清液，置于冰上。之后按照试剂盒步骤依次加入试剂，混匀，室温静置30 min，加入1 mL 比色皿中，测定各处理在560 nm 处的吸光度（测定前将分光光度计预热30 min 以上，并调节波长至560 nm，用蒸馏水调零）。按照下式计算各处理样品SOD 酶活性。

式中：I为抑制百分率；M为样本质量；C为对照管；D为吸光度测定管。

1.4 数据分析

采用EXCEL2019 和SPSS26 软件对数据进行处理、统计分析和作图。

2 结果分析

2.1 干旱胁迫下三种胡枝子幼苗的相对含水量

15% 的PEG 溶液模拟干旱胁迫不同时间梯度下，3 种胡枝子幼苗的相对含水量变化如图1 所示。从图1 可以看出，在未受胁迫的条件下，牛枝子的相对含水量最高，为90.75%，其次是尖叶胡枝子（89.82%），相对含水量最低的是达乌里胡枝子（83.99%）。

图1 不同时间梯度15% PEG 溶液干旱胁迫下三种胡枝子的相对含水量变化Fig.1 Changes of relative water content of three kinds Lespedeza lines under different time gradients of 15% PEG solution drought stress

随着胁迫（15%PEG 溶液处理）时间的延长，尖叶胡枝子和牛枝子的幼苗相对含水量均呈现下降趋势，但二者对干旱胁迫的响应情况有所不同。尖叶胡枝子在胁迫6.5 h、13 h 时与未胁迫对照相比差异不显著（P>0.05），在胁迫19.5 h 时，其幼苗相对含水量发生显著下降（P<0.05）；而牛枝子在胁迫6.5 h 时，幼苗相对含水量发生显著下降（P<0.05），为80.10%，之后随着胁迫时间的延长，其幼苗相对含水量基本保持稳定（P>0.05）。

达乌里胡枝子幼苗在15%PEG 溶液处理6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 下的相对含水量与其未胁迫对照相比差异均不显著（P>0.05），其幼苗对干旱胁迫表现出了相对较好的耐受性。

2.2 干旱胁迫下三种胡枝子幼苗相对电导率

理论上，植物受到干旱胁迫时，若细胞膜结构受到伤害，则会引起细胞膜透性增大，细胞内容物外渗，使外渗液电导值增大。三种胡枝子相对电导率随胁迫时间的变化如图2 所示。由图2 可见，在未受胁迫的环境下，达乌里胡枝子的相对电导率最高，为30.62%，其次是尖叶胡枝子（26.86%），相对电导率最低的是牛枝子（14.82%）。

图2 不同时间梯度15%PEG 溶液干旱胁迫下三种胡枝子电导率变化Fig.2 Changes of electrical conductivity of three kinds Lespedeza lines under different time gradients of 15% PEG solution drought stress

随着胁迫时间的延长，尖叶胡枝子和达乌里胡枝子的幼苗相对电导率均在6.5 h 时，出现了下降趋势，但尖叶胡枝子的各个处理和对照之间均差异不显著（P>0.05）。达乌里胡枝子在胁迫6.5 h 时，幼苗电导率显著低于对照（P<0.05），在处理6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 之间差异不显著（P>0.05），但均显著低于对照（P<0.05）。

牛枝子在胁迫6.5 h 时，幼苗相对电导率亦发生显著下降（P<0.05），降为11.56%，之后随着胁迫时间的延长，从整体来看产生了上升趋势。

2.3 干旱胁迫下三种胡枝子幼苗丙二醛含量

植物在干旱胁迫到超过其可以承受的程度时，会产生膜脂过氧化作用。膜脂过氧化的最终结果是产生丙二醛。丙二醛的积累对膜和细胞造成一定的伤害。

三种胡枝子的幼苗，在6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 各个时间点处理的丙二醛含量与未经处理的对照相比，经统计分析差异均不显著（P>0.05），如图3 所示。表明15% 的PEG 溶液模拟干旱胁迫6.5 h~26 h，尚未对参试的尖叶胡枝子、牛枝子和达乌里胡枝子的细胞膜产生显著伤害。

图3 不同时间梯度15% PEG 溶液模拟干旱胁迫下三种胡枝子丙二醛含量变化Fig.3 Changes of MDA of three kinds Lespedeza lines under different time gradients of 15% PEG solution drought stress

2.4 干旱胁迫下三种胡枝子幼苗超氧化物歧化酶活性

超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，植物细胞膜系统的重要保护酶之一，在细胞抗氧化、衰老 中 起 着 至 关 重 要 的 作 用［10］。 经15%PEG 溶液模拟干旱胁迫6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 后，3 种供试胡枝子幼苗的SOD 活性都有不同程度提高，但不同胡枝子间的变化趋势不同（图4）。由图4 可知，尖叶胡枝子在未经胁迫处理时，其SOD 活性为59.72 U/mg，之后随着胁迫时间的延长，SOD 活性逐渐增强，当胁迫时间达26 h，达到显著水平（P<0.05）。此时其SOD 活性为132.64 U/mg，比未经胁迫的对照增加了72.92 U/mg，SOD 活性提高了122%。

图4 不同时间梯度15% PEG 溶液模拟干旱胁迫下三种胡枝子超氧化物歧化酶活性变化Fig.4 Changes of SOD of three kinds Lespedeza lines under different time gradients of 15% PEG solution drought stress

牛枝子在未经干旱胁迫处理时，其SOD 活性为63.11 U/mg，之后随着胁迫时间的延长，SOD 活性呈先升高后下降的趋势。具体表现为：在胁迫时间6.5 h 至13 h 时，SOD 活性快速升高，并在胁迫13 h 时达到高峰，且与对照相比差异显著（P<0.05）。此时其SOD 活性达到108.04 U/mg，比对照增加了44.93 U/mg，SOD 活性提高了72%。

达乌里胡枝子在未经干旱胁迫处理时，其SOD 活性为67.63 U/mg，之后随着胁迫时间的延长，SOD活性也呈先升高后下降的趋势。具体表现为：在胁迫时间6.5 h 至13 h 时，SOD 缓慢升高，在胁迫19.5 h时达到高峰，且与对照相比差异显著（P<0.05）。此时其SOD 活性达到121.97 U/mg，比对照增加了54.33 U/mg，SOD 活性提高了80.72%。

3 结论与讨论

相对含水量与植物的代谢活动密切相关，是用于研究植物抗旱性的重要生理指标之一［8］。有研究表明，植物通过保持较高水平的叶片相对含水量来实现对干旱条件的适应［9］。本研究结果显示，尖叶胡枝子和牛枝子的幼苗相对含水量，随胁迫时间的延长均呈现下降趋势，这与谭莎等［10］在研究3 个山茶品种受水分胁迫后的相对含水量变化趋势的结果相一致。本研究中牛枝子在15%PEG 溶液胁迫6.5 h 时，幼苗相对含水量便发生显著下降（P<0.05），之后随着胁迫时间的延长其相对含水量基本保持稳定（P>0.05）；尖叶胡枝子在胁迫19.5 h 时，其幼苗相对含水量才发生显著下降（P<0.05）；而达乌里胡枝子幼苗在6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 各个处理条件下的相对含水量与其未经胁迫的对照相比差异均不显著（P>0.05），这一研究结果与马彦军等［11］的PEG 胁迫后牛枝子含水量最多，尖叶胡枝子含水量较少的研究结果略有不同。本研究结果表明3 种胡枝子对PEG 胁迫的生理响应不同。

植物细胞主要是由膜系统组成的多分子动态体系。干旱造成膜结构及其功能伤害的根本是因为脱水导致膜构型改变和膜脂过氧化作用，进而降解膜蛋白和使其变性等，导致细胞内溶质外渗，引起电导率的上升［12］。本研究中尖叶胡枝子、达乌里胡枝子和牛枝子的幼苗相对电导率，均在胁迫6.5 h 时，出现了下降趋势。其原因可能是15% PEG 溶液短时间的处理，激发了其植物体内某种防御机制，减少了细胞内溶质的外渗。从3 个品系对各个时间梯度胁迫处理的整体响应来看，存在差异。

丙二醛为膜脂过氧化产物，其含量可以直接反映细胞膜脂过氧化程度，从而间接反映植物的受害程度［13］。在干旱程度严重情况下，活性氧大量积累，引发细胞膜脂过氧化，从而使细胞膜受到伤害，导致丙二醛含量上升。本研究中，3 种胡枝子在各个时间梯度处理下的丙二醛含量与其未经处理的对照相比，差异均不显著（P>0.05），表明15% 的PEG 溶液模拟干旱胁迫6.5 h~26 h，尚未对参试的3 种胡枝子幼苗细胞膜造成显著伤害，膜脂过氧化尚未发生或者已经发生但程度较轻。

超氧化物歧化酶是植物体内重要的抗氧化酶，能有效清除活性氧，进而保护膜系统［14］。本研究中15%PEG 溶液模拟干旱胁迫6.5 h、13 h、19.5 h 和26 h 后，3 种胡枝子幼苗的SOD 活性都有不同程度的提高。这一研究结果与刘承等［15］在玉米抗旱性上的研究结果相同。不同胡枝子对各个胁迫处理的SOD 响应不同。尖叶胡枝子在胁迫时间达26 h 时，SOD 活性显著增加并达到高峰，为132.64 U/mg，比对照提高了122%；牛枝子在胁迫13 h 时达到高峰，为108.04 U/mg，比对照提高了72%，与对照相比差异显著（P<0.05）；达乌里胡枝子在胁迫19.5h 时达到高峰，为121.97 U/mg，比对照提高了80.72%，且与对照相比差异显著（P<0.05）。

植物的抗旱性是多种因素综合作用的结果［15］。因此，某一项生理指标难以全面、准确地反映出其抗旱生理响应情况。需要结合多个指标综合分析，本研究进一步将结合分子水平的研究，深入探讨其抗旱机制。