盐分对不同种植年限水稻土氮转化功能基因的影响

肖锚，俞永祥，姚槐应，*

(1. 武汉工程大学 环境生态与生物工程学院，武汉 430205；2. 中国科学院 城市环境研究所，福建 厦门 361021)

土壤盐渍化引起的土壤退化是全球典型的生态问题。目前，中国盐碱地总面积约3.6×107hm2，其中超过 1.3×106hm2位于滨海区域[1]。将滨海盐碱滩涂围垦成农田，实现了从盐碱地到可利用耕地的转变，缓解了耕地不足的现状。然而，盐分也是限制滨海稻田土壤养分循环与利用的关键制约性因子。盐分升高会改变土壤理化性质和微生物群落的功能[2-3]，进而改变了土壤氮素循环过程。在农田生态系统，氮素是限制农作物产量的关键因素，土壤微生物驱动下有机氮的分解作用、铵态氮的硝化作用和硝态氮的反硝化作用是决定农作物氮素利用效率的关键[4]。盐分增加通常会抑制土壤硝化和反硝化微生物活性[5]，进而限制了土壤氮素供应和转化过程。当前关于盐分对土壤氮素转化及其微生物调控机制的研究开展较多[6-7]，但盐分对土壤氮转化的微生物功能基因的研究较少。Zhou等[8]基于meta分析方法，发现盐渍化显著增加了土壤铵态氮含量，降低了土壤硝态氮含量，但对土壤硝化和反硝化过程的影响存在较大差异。微生物是驱动土壤氮素转化的引擎，不同土壤中氮循环相关微生物群落的差异，可能是导致盐渍化对土壤氮素转化过程的影响存在较大差异的原因。将滨海滩涂围垦成稻田是一种常见的土地利用方式，形成了具有不同种植年限的水稻土。围垦早期的稻田土壤普遍存在含盐量高、养分贫瘠和渗透性差等问题，土壤氮素周转速率慢，农作物利用氮素效率低[9]。但随着水稻种植年限的增加，水稻土中驱动养分循环的微生物丰度和多样性逐渐稳定，而且土壤中氮素积累和消耗也达到动态平衡[10-11]。因此，稻田耕作年限增加可能会降低盐分对土壤氮素转化以及硝化和反硝化微生物的影响程度。然而，关于盐分对不同种植年限水稻土氮素转化微生物功能基因影响的研究较少。本研究以滨海稻田土壤为研究对象，探究盐分对不同种植年限稻田土壤矿质氮及氮素转化功能基因的影响，以期为“防止土壤盐渍化，提高土壤生产力”提供数据支撑。

1 试验材料与方法

1.1 供试土壤

供试土壤采集自江苏省盐城市不同种植年限(3年、15年和40年)的水稻田(32°50′3″N～32°56′51″ N，120°28′28″ E～120°56′39″ E)，该地区属于亚热带季风气候，多年平均气温为14.8℃，多年平均降水量为1 015.0 mm。采用棋盘法采集土壤表层土(0～20 cm)并充分混匀。挑出土壤中根、茎和石头等杂物后过2 mm筛，在4℃下储藏备用。试验前测定的土壤基本理化性质见表1。供试土壤长期冷藏保存后土壤硝态氮含量较高，主要归因于低温保存虽然抑制了土壤净氮矿化和铵态氮消耗，但会增加土壤净硝化和硝酸盐固持速率[12]。不过，本试验中冷藏保存的土壤经过两周的预培养后，硝态氮含量会接近新鲜土壤样品[13]，最大限度保证了试验结果的可靠性。

1.2 试验设计

为探究水稻种植年限和盐分的交互作用对矿质氮及氮素转化微生物功能基因的影响，试验处理如下：(1)供试水稻土种植年限分别为3年、15年和40年；盐碱化水稻土种植15年后，土壤微生物多样性逐渐稳定，氮素转化过程也达到动态平衡[10]。(2)0.2%和0.6%和盐分，分别代表中度盐渍化与重度盐渍化[9]。试验共6个处理，每个处理3个重复。

试验开始前，称取干重为15 g的水稻土置于120 mL血清瓶中进行两周的培养。对于0.2%含盐量处理，对不同耕作年限水稻土中加入相应的超纯水，使得土壤水含量达到饱和状态。对于0.6%含盐量处理，按照Kester人工海水配方比例[14]，向土壤加入NaCl∶Na2SO4∶KCl∶NaHCO3比为23.93∶4.01∶0.68∶0.20的盐分溶液。本试验中，供试3年、15年和40年种植年限的水稻土中添加的盐分总量分别为55.5、61.5和59.25 mg，并调节土壤含水量至饱和状态。最后，将装有供试水稻土的血清瓶放在25℃培养箱中，并加入0.15 g(1%)的水稻秸秆(碳、氮和碳氮比分别为38.59%、0.92%和41.91%)，充分混匀，用于提高微生物活性。培养期间按照称重法补充土壤水分，并在第48天进行破坏性取样，用于测土壤矿质氮含量及土壤氮转化的微生物功能基因。

1.3 土壤矿质氮含量及氮转化微生物功能基因的测定

将3 g鲜土加入15 mL的2 M KCl溶液中振荡1 h后，通过滤纸过滤获取浸提液，采用流动分析仪(Skalar SAN++ System, Skalar Analytical B.V., Breda, Netherlands)测定土壤铵态氮(NH4+)和硝态氮(NO3-)含量。

将部分土样置于-80℃下冷冻干燥处理后，按照土壤DNA提取试剂盒(FastDNATMSPIN Kit for soil)提供的方法提取500 mg土壤样品中的DNA。以16S rRNA基因(F515/R907)作为参考基因，使用高通量定量PCR方法测定编码氮矿化(gdhA)、硝化(AOAamoA、AOBamoA、amoB、hao和nxrA)和反硝化(narG、nirK1、nirK2、nirS1、nirS2、nosZ1和nosZ2)有关的微生物功能基因相对丰度。PCR条件是：95℃预变性10 min；95℃变性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸30 s，共扩增40个循环，PCR扩增的引物及其序列详见表2[15]。SmartChip qPCR软件自动剔除有多个WaferGen自动生成的溶解曲线以及扩增效率>120%或<80%的结果，选择小于31的结果阈值(CT)计算基因相对丰度(GR)[16]：

表2 本研究中用于PCR扩增的引物及其序列Table 2 Primers and their sequences for PCR amplification in this study

基因相对拷贝数GR=(31-CT)/(10/3)

(1)

为计算氮转化功能基因的绝对丰度(GAfun)，按照Zheng等[16]采用的方法计算：

基因绝对拷贝数GAfun=GA16s·GRfun/GR16S

(2)

式(2)中：GA16s和GR16S分别表示16S rRNA基因的绝对丰度和相对丰度，GAfun和GRfun分别表示不同氮转化功能基因的绝对丰度和相对丰度。16S rRNA绝对丰度采用qPCR测定。

1.4 数据处理与统计分析

用Excel 2019统计并处理数据，用SPSS 26软件对数据进行单因素及双因素方差分析，用Origin 2021软件做图，图中的误差棒均为标准误差。不同处理之间的多重比较采用最小显著法(LSD)，用不同小写字母表示不同处理间存在显著性差异(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 盐分对不同种植年限水稻土矿质氮的影响

盐分以及盐分与水稻种植年限的交互作用显著(P<0.05)影响了土壤NH4+含量(图1a)。对于种植3年的水稻土，盐分对土壤NH4+没有显著(P>0.05)影响，0.2%和0.6%含盐量的土壤NH4+含量分别为0.69和0.74 mg·kg-1。对于种植15年和40年的水稻土，盐分增加显著(P<0.05)提升了土壤NH4+含量。0.2%和0.6%含盐量下，种植15年水稻土NH4+含量分别为0.26和1.51 mg·kg-1，种植40年的水稻土NH4+含量分别为0.21和0.32 mg·kg-1。

盐分以及盐分与水稻种植年限的交互作用对土壤NO3-没有显著影响(P>0.05)(图1b)。对于种植3年和15年的水稻土，盐分对土壤NO3-没有显著(P>0.05)影响。0.2%含盐量下，3年和15年水稻土NO3-含量分别为1.53和1.66 mg·kg-1；而0.6%含盐量下，3年和15年水稻土NO3-含量分别为1.38和1.46 mg·kg-1。盐分增加显著(P<0.05)降低了种植40年水稻土NO3-含量，0.2%和0.6%含盐量土壤NO3-含量分别为1.12和0.85 mg·kg-1。

2.2 盐分对不同种植年限水稻土氮转化功能基因的影响

基于高通量定量PCR技术，共检测到编码氮矿化(gdhA)、硝化(AOBamoA和amoB)和反硝化(narG、nirK、nirS和nosZ)转化酶的微生物功能基因。不同水稻土中，编码亚硝酸盐还原酶的nirS基因丰度相对较高(1.42×107～4.38×107)，其次为编码氮矿化酶的gdhA(1.99×106～5.66×106)、氧化亚氮还原酶的nosZ基因(1.43×106～5.24×107)和氨氧化细菌硝化的amoA(1.63×105～1.71×106)；而编码硝酸盐还原酶的narG(3.25×104～5.32×104)和亚硝酸盐还原酶的nirK(2.55×104～1.43×105)基因丰度相对较低(图2)。

盐分、水稻土种植年限及其交互作用显著(P<0.05)影响了gdhA、amoA和amoB基因丰度(表3，图2)。对于水稻土有机氮矿化过程，盐分增加对种植3年的水稻土gdhA基因没有显著影响，但使得种植15年和40年水稻土gdhA基因丰度显著增加。对于水稻土硝化过程，盐分对不同种植年限的amoA和amoB基因的影响存在差异。盐分增加使得种植3年和15年的水稻土amoA基因丰度显著降低，但对种植40年水稻土amoA基因丰度没有显著影响。盐分增加分别使得种植3年、15年和40年水稻土amoB基因丰度显著降低、无显著影响和显著增加。

表3 盐分、水稻种植年限及其交互作用对氮循环功能基因的影响Table 3 Salinity，cultivated years and their interaction effects on microbial functional genes involved in nitrogen transformation

反硝化过程中，盐分及其与水稻土种植年限的交互作用对narG和nirS基因没有(P>0.05)显著影响(表3，图2)，盐分增加仅使得种植40年的水稻土narG基因丰度显著(P<0.05)增加。盐分、水稻种植年限及其交互作用对nirK和nosZ基因均产生显著影响(P<0.05)。对于亚硝酸盐还原过程，盐分增加使得种植15年和40年水稻土nirK基因丰度显著增加，对种植3年的水稻土nirK基因没有显著影响。对于N2O还原过程，盐分增加使得不同种植年限水稻土的nosZ基因丰度均显著增加。

2.3 土壤理化性质与氮转化功能基因的相关性分析

土壤理化性质(盐分、有机碳、铵态氮和硝态氮)可解释土壤氮转化微生物功能基因74.2%的变异(图3)。NH4+与gdhA基因和amoB基因呈正相关关系，与AOBamoA基因相关性不大，而NO3-与amoB存在正相关关系，与其他硝化和反硝化功能基因相关性不大。盐分含量与nosZ基因呈正相关关系，与AOBamoA呈负相关关系。土壤有机碳含量与nirK、nirS和gdhA呈正相关关系，与AOBamoA呈负相关关系。

3 讨论

盐渍化通常会抑制土壤微生物的生长和活性，进而降低了微生物驱动下的土壤有机氮矿化速率[8,17]。但Zhou等[8]基于meta分析发现，盐分增加提升了土壤有机氮的净矿化速率，但抑制了NH4+的生物固持，进而显著增加了土壤NH4+含量。结果发现，水稻土熟化程度可能控制了盐分对土壤有机氮矿化及NH4+含量的影响。对于种植15年和40年的水稻土，盐分增加使得编码土壤有机氮矿化酶的gdhA基因丰度增加，进而通过促进土壤有机氮矿化增加了土壤NH4+含量。但对于种植3年的水稻土，盐分增加对土壤NH4+含量和gdhA基因丰度均没有显著影响。究其原因，可能是种植水稻15年后，土壤氮素累积和消耗的动态平衡以及微生物群落演化均达到稳定状态[10]，使得盐分对土壤有机氮矿化存在显著影响。但种植3年的水稻土微生物丰富度和多样性可能较低[10]，盐分对微生物驱动下土壤矿化过程的影响存在较大的不确定性，导致盐分对土壤有机氮矿化没有显著影响。

盐渍化会改变土壤氨氧化微生物群落结构和功能，进而对土壤硝化过程存在低盐促进、高盐抑制的作用[18-19]。本研究的冗余分析结果与前人研究结果一致，水稻土氨氧化细菌的amoA丰度与盐分呈负相关关系，表明盐分增加抑制了土壤氨氧化细菌功能基因的表达。不过，李明[20]等发现枸杞园土壤氨氧化古菌对盐分变化不敏感，表明盐分对氨氧化细菌和氨氧化古菌的影响存在较大差异。因此，在考虑盐分对土壤氨氧化过程中，应定量区分盐分对氨氧化细菌和古菌对土壤硝化过程的相对贡献。此外，盐分对不同种植年限水稻土氨氧化细菌的影响存在较大差异。对于种植3年和15年的水稻土，较高盐分水平下水稻土amoA基因丰度较低，可能抑制了土壤硝化过程。但对于种植40年的水稻土，盐分对水稻土amoA基因丰度没有显著影响。该结果表明，随着水稻土逐渐熟化，盐分对土壤氨氧化细菌的影响程度逐渐降低。水稻是喜铵植物，对于熟化程度较低的水稻土，盐渍化除了对水稻生长产生胁迫外，还可能抑制土壤硝化速率，不利于水稻利用有机氮分解产生的氮素。因此，在滨海盐碱滩涂围垦成农田前期，除了种植具有耐盐能力的水稻外，应适当增加铵肥输入量，保证作物产量。

较高的盐分含量会抑制土壤硝化过程，减少可供土壤反硝化微生物利用的NO3-底物，进而降低土壤反硝化速率[21]。但Zhou等[8]基于meta分析发现，盐分对土壤硝化过程以及土壤NO3-含量均没有显著影响，可能是土壤中参与氮循环的相关微生物存在较大差异，减缓了盐渍化对土壤反硝化过程的限制作用。本研究结果表明，盐分使得种植3年和15年的水稻土氨氧化细菌amoA丰度降低，但并未显著影响土壤NO3-含量；对于有40年种植历史的水稻土，盐分增加使得编码硝化过程的amoB基因丰度显著增加，但也使得编码硝酸盐还原酶的narG基因丰度增加，进而使得土壤NO3-含量显著降低。不仅如此，盐分增加还会抑制硝酸盐还原产生的亚硝酸盐氧化过程[17]，导致亚硝酸盐的积累，并对水稻生长产生毒害。稻田土壤通常处于淹水环境，土壤中氧气不足，更有利于亚硝酸盐积累。因此，对于熟化程度较高的盐渍化水稻田，需要适当开展排水晒田，减轻亚硝酸盐污染对水稻生长产生的危害。

土壤盐渍化会抑制土壤反硝化过程，盐分过高甚至使得土壤反硝化过程完全终止[17]。有研究发现盐分增加会减少沉积物中nirK和nosZ基因丰度，但对nirS基因没有显著影响[22]，即盐分增加会抑制土壤反硝化过程中的亚硝酸盐和N2O还原过程。而本研究发现盐分增加使得nirK和nosZ基因丰度显著增加，但对nirS基因没有显著影响，可能归因于水稻土中编码nirS功能基因的微生物活性较高[23]，对盐分增加具有更高的抵抗力有关。不同种植年限的水稻土，较高的含盐量下nosZ基因丰度较高，可通过促进水稻土N2O还原过程而减少N2O排放。因此，在估算盐渍化稻田土壤温室气体排放过程中，需要考虑盐分对土壤N2O排放的抑制作用。不过，有研究发现盐渍化虽然增加了编码N2O还原酶的nosZ功能基因丰度，但可能通过增加真菌反硝化强度，进而存在较高的土壤N2O排放风险[24]。因此，未来需要结合大田试验，探究盐分增加对不同耕作年限水稻土N2O排放的影响，量化真菌反硝化过程对土壤N2O释放量的贡献。

4 结论

1)盐分对稻田土壤有机氮矿化及土壤NH4+含量的影响受水稻种植年限的影响。对于种植15年和40年的水稻土，盐分增加使得编码土壤有机氮矿化的gdhA基因丰度增加，进而提升了土壤NH4+含量；但对于种植3年的水稻土，盐分对gdhA基因丰度和NH4+含量均没有显著影响。

2)盐分对土壤NO3-含量的影响取决于水稻种植年限。对于种植40年的水稻土，盐分增加使得编码NO3-还原酶的narG基因丰度增加，进而使得土壤NO3-含量显著降低。对于种植3年和15年的水稻土，盐分对narG基因丰度和NO3-含量没有显著影响。

3)对于不同水稻种植年限的土壤，盐分增加均使得编码N2O还原酶的nosZ基因丰度显著增加，可能利于提升水稻土N2O还原强度，进而减少土壤N2O排放。