离体小鼠股骨骨小梁与骨皮质CT样品制备探索

王战京，武文琦，赵媛媛，雷建锋

（首都医科大学中心实验室，北京 100069）

小动物活体分子影像学是近些年来新兴的交叉学科，其使用影像手段显示组织水平、细胞和亚细胞水平的特定分子，进而了解活体动物体内的相关生理变化[1-3]。显微CT（Mirco-CT）是小动物活体分子显像影像学重要的实验方法，它适用于研究对象为小型啮齿类动物（小鼠，大鼠等），可无创、定量、多次重复的提供小动物骨组织与肺组织结构学变化[4，5]。同时它还是对离体小动物骨组织进行骨密度、骨小梁测量的重要手段[6-8]。小动物CT 对骨密度进行测算的原理是通过测量X 射线衰减系数（AC）与该材料的质量密度的相关性进行配准计算，从而得出实验样品的密度。本次实验主要探索不同的样品制备方法对离体小鼠股骨骨小梁密度（BMD）和骨皮质密度（TMD）CT 定量测量的影响，为小动物离体样品制备和CT 扫描提供选择依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8 周雌性BALA/C 小鼠20 只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。取出40 根小鼠股骨浸泡于戊二醛溶液1 周，股骨重量0.13～0.8 g，长度5.3～4.8 cm。实验中对动物的处置符合动物伦理学研究准则。

1.2 仪器设备和软件 仪器设备为BRUKER 公司in-vivo X-ray Microtomograph SkyScan-1276，由首都医科大学中心实验室提供，扫描系统为SKSCAN-1276 SYSTEM OVERVIEW，重建系统为SkyScan NRecon，2D 图像观察与校正软件为SkyScan DataViewer，3D 图像展示软件为SkyScan Volume Rendering，图像分析软件为SkyScan 2D/3D Image Analysis。

1.3 分组及方法 采用随机数字表法将40 根小鼠股骨分为无水合制备组和水合制备组，每组20 根。按照不同的方法制备实验样品，然后在相同条件下对样品采用相同扫描参数进行扫描。无水合制备组于扫描当天直接从戊二醛溶液中取出离体小鼠股骨，扫描过程中采用直接暴露在空气中。水合制备组于扫描前1 d 将固定于戊二醛溶液中的离体小鼠股骨放入EP 管中，加入纯净水进行12 h 水合，扫描过程中内部采用湿润纸巾包裹，外边再包保鲜膜，模拟小鼠股骨在活体的环境下进行Micro-CT 扫描。

1.4 图像采集与骨密度计算 将标本水平固定于样品床上，使标本与样品床旋转中心保持一致。选择的扫描参数：矩阵2048×2048×116，电压57 kV，电流72 μA，图像分辨率5 μm/piex，曝光时间1300 ms,旋转步长0.4 度，滤光片选择厚度为0.25 mm 的Al，旋转度数为206°，扫描时间22 min。扫描完成后，再用布鲁克公司提供的密度标准样品羟基磷灰石（CaHA）密封分别为0.25 g/cm3和0.75 g/cm3进行相同条件下CT 扫描[9-11]。扫描结束后分别对标准样品与股骨头使用SkyScan NRecon 进行相同参数的样品重建，参数设置为平滑度为3，射线硬度设为60%。重建完成后使用SkyScan DataViewer 对标准样与小鼠股骨进行物理位置的校正，校正结果为样品在图像中心，见图1；样品摆放整齐以便于下一步对其进行分析，图像调整完毕后划出感兴趣区域（VOI）在对图像进一步进行重建，使在不损失图像质量的前提下，去除空白的像素区域，让文件变小以便于后期处理，见图2。图像预处理结束后，使用SkyScan 2D/3D Image Analysis 对分析部位制作3D 重构图。BMD：起始位置从纵切面距离生长板远端1.5 mm 处开始向下取3.00 mm；TMD：起始位置从纵切面距离生长板远端6 mm 处腔内没有骨小梁分布处开始向下取3.00 mm。选取小梁内部区域与骨皮质外部区域同时进行重组获得3D 图像，图像信息设为最低阈值[12-14]。使用SkyScan Volume Rendering 软件对重建的3D 图像进行展示。对骨组织重组的图像使用SkyScan 2D/3D Image Analysis进行定量分析，可以得到BMD 值和TMD 值。首先测量标准样品的射线吸收率，建立骨密度计算公式，再将需要测量的骨组织的射线吸收率代入公式计算出相应的骨密度。

图1 SkyScan DataViewer 对标准样和小鼠股骨进行物理位置校正

图2 重建感兴趣区域

1.5 统计学方法 采用统计学软件SPSS 17.0 进行数据分析，计量资料采用（±s）表示，使用配对t检验，置信区间设为95%。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨小梁与骨皮质3D 重建结果 使用SkyScan Volume Rendering 软件展示重建的3D 图像，见图3。

图3 3D 骨小梁结构和3D 骨皮质内部结构

2.2 两组BMD 检测结果比较 水合制备组BMD 检测结果高于无水合制备组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1～表3。

表1 两组BMD 检测结果

表2 两组BMD 检测结果描述统计量

表3 两组BMD 成对差分检测结果t 检验结果

2.3 两组TMD 检测结果比较 两组TMD 检测结果比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表4～表6。

表4 两组TMD 检测结果

表5 两组TMD 检测结果描述统计量

表6 两组TMD 成对差分检测结果t 检验结果

3 讨论

小鼠是最常用的实验动物之一，在骨科医学、口腔医学中常常用于各类疾损伤修复的研究。CT 对骨组织成像有独特优势，在临床疾病诊断中有重要意义，是目前最为广泛的检测项目之一[15-18]。Mirco-CT作为骨组织形态计量学的重要检测手段具有不可替代性，尤其是对BMD 和TMD 的测量具有突出优势。精度可以达到微米级别，能够清晰的分辨骨小梁结构，精准测算出骨小梁与骨皮质的密度等相关数据，再配合三维重构软件、几何测量软件，可以对各类硬组织进行精准观测。动物离体骨具有便于保存，有助于各类实验顺利展开，在医学科研领域研究使用十分广泛[18]。而离体骨的检测与活体骨组织检测由于存在环境不同，实验结果存在一定的差异。如何让保存的离体骨的测量结果更加接近与真实的活体检验结果，一直是实验员探讨的课题之一。同时在不影响扫描结果的前提下，如何短时间测量打样品量也是实验室科学探索方向之一。

本次研究显示，水合制备组BMD 检测结果高于无水合制备组，差异有统计学意义（P＜0.05）；说明两种制备方法样品对CT 扫描结果存在差异。由于显微CT 扫描测试是小动物骨小梁BMP 分析的金标准，其中骨小梁密度作为重要参数之一，测量结果直接影响的实验结果的准确性。通过结果可以看出水合后CT 扫描结果密度增加，更加接近与动物体内真实数值；同时观察骨小梁结构状态无明显变化。本次研究中，两组TMD 检测结果比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。说明两种制备方法样品对CT 扫描结果存在差异不明显。TMD 作为CT 扫描重要参数之一，测量结果直接影响实验结果的准确性。无水合与水合后CT 扫描结果密度无明显差异，说明骨皮质密度高，水分子很难渗透到骨皮质之中，无水合不影响CT 扫描结果。

Mirco-CT 是骨密度检测的金标准，它的结果可衡量前期实验动物模型建立是否成功，同时对下一步动物实验的修复治疗提供重要参考依据。因此，建议使用水合制备法以使实验结果更加准确。需要说明的是，本次研究实验的数量相对较少，并且采用单一的小鼠股骨，没有对大鼠以及裸鼠进行比较，研究使用的仪器也比较单一。今后需要更多的相关研究确保其有效性、实用性，从而为临床前实验动物研究提供有力保障。

综上所述，无水合制备法直接影响了BMD 的测量结果准确性，对TMD 的测量结果产生的影响较小，使用水合制备法更能保证实验结果的准确性。