上海郊区猪戊型肝炎病毒分子流行病学调查

周佳明,陈 冈,司伏生,于瑞嵩,陈冰清,谢春芳,李 震,董世娟∗

(1 上海市金山区动物疫病预防控制中心,上海 201540;2 上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海市农业遗传育种重点实验室,上海市种猪育种工程中心,上海 201106)

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的通过消化道感染的急性病毒性肝炎,主要通过污染的水和食物经粪-口传播,也可经血液、母婴传播[1-2]。 人群中戊型肝炎的病死率较甲型、乙型、丙型和丁型肝炎高,青壮年戊肝病死率可达1%—2%,患病孕妇的病死率高达21%[3],给人类健康造成了严重威胁。 研究证实,HE 是人畜共患传染病[4],HEV 可跨种间传播[5-7],多种动物是HEV 的重要宿主[8-9],且猪是公认的HEV 重要储存宿主和传染源,国内外均有猪HEV 传染人类的报道[10]。 HEV 有1 个血清型和4 个基因型。 基因1 型、2 型只感染人,而3 型、4 型为人畜共患型,可感染人和多种动物。 基因1 型主要流行于西亚、我国新疆等地区及非洲的部分地区;基因2 型流行于中美洲墨西哥等国,基因3 型最初流行于欧洲、北美以及新西兰,近年来也开始在亚洲的国家和地区流行,如日本、韩国、中国等。 基因4 型主要在亚洲各国和地区流行。 在我国,人感染的HEV 基因型包括1 型、3 型和4型[11],猪场流行的HEV 主要为3 型和4 型[12]。

HEV 在我国猪群中广泛存在,Zhou 等[13]对我国不同地区的1 768 头商品猪血清样本进行流行病学分析,发现HEV 抗体总阳性率达到67.14%(四川62.75%、福建67.03%、湖北62.50%、安徽62.81%、江西73.73%、宁夏73.1%、甘肃70.81%)。 Ning 等[12]对上海郊区猪场粪便样本进行HEV 分子流行病学调查,发现26%的样本为HEV 阳性。 纪方晓等[14]对广东不同猪场的猪胆汁样本进行分析,发现HEV 的阳性率为6.8%。 为了解上海郊区猪场猪戊型肝炎的最新流行状况,本研究对上海郊区部分猪场进行HEV 分子流行病学调查和流行毒株的遗传进化分析,以期为HEV 的防控和公共卫生安全提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

采集上海郊区3 个猪场猪粪便样本共180 份,其中2 月龄仔猪粪便样本60 份,5—6 月龄育肥猪粪便样本60 份,母猪粪便样本60 份。 粪便样品用灭菌的PBS 制成10% 粪便悬液,震荡混匀,于4 ℃、12 000 r∕min 离心10 min,收集上清,置于-80 ℃冰箱保存待检。

1.2 主要试剂

病毒RNA 提取试剂盒为北京天根生化科技有限公司产品;一步法高效RT-PCR 试剂盒为南京诺唯赞生物科技有限公司产品;凝胶DNA 回收试剂盒为爱思进生物技术(杭州)有限公司产品;E.coli DH5α 感受态细胞为实验室制备保存;Clone JET PCR Cloning Kit 载体为赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品。

1.3 引物

利用巢氏PCR 引物扩增ORF2 基因的部分片段,长度为189 bp。 所用引物序列为外侧引物:H1(5’-CTGTTTAAYCTTGCTGACAC-3’) 和 H2 (5’-WGARAGCCAAAGCACATC-3’); 内 侧 引 物 H3 (5’-GACAGAATTGATTTCGTCG-3’)和H4(5’-TGYTGGTTRTCRTAATCCTG-3’)。

1.4 病毒总RNA 抽提

按照病毒RNA 快速纯化试剂盒说明书进行操作,抽提的RNA 溶解在30 μL RNase-free 的DEPC 水中,并保存于-80 ℃冰箱。

1.5 ORF2 基因扩增

ORF2 基因扩增采用巢氏RT-PCR 反应进行,首先利用一步法高效RT-PCR 试剂盒扩增HEV ORF2 基因。 一步法总反应体系为25 μL:2 ×One Step Mix 12.5 μL,One Step Enzyme Mix 1.25 μL,外侧引物H1、H2 各1 μL,RNA 9.25 μL。 反应条件为:50 ℃30 min,94 ℃3 min;94 ℃30 s,53 ℃30 s,72 ℃50 s,34个循环;72 ℃延伸5 min。 利用第一轮PCR 产物进行第二轮扩增,反应体系为:2 ×Taq PCR Mix 6.25 μL,内侧H3、H4 各0.5 μL,DEPC 水2.25 μL,cDNA 3 μL。 反应条件为:94 ℃3 min;94 ℃30 s,53 ℃30 s,72 ℃40 s,35 个循环;72 ℃延伸5 min。

1.6 PCR 产物克隆、序列测定和比较分析

PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后,克隆至pJET 1.2∕blunt 载体中,转化后挑取阳性克隆进行PCR 鉴定,提取质粒,送铂尚生物技术(上海)有限公司测序。 将测定结果在NCBI 数据库中进行BLAST比对分析,鉴定基因型;分别在经鉴定为基因3 型和4 型的样本中选择序列有差异的代表性样本(样本按照猪场所在区名的首字母+阳性样本的顺序号命名)与GenBank 中登录的34 条HEV 的ORF2 基因的核苷酸序列进行同源性分析,并利用DNAstar 软件进行遗传进化分析。

2 结果与分析

2.1 粪便样品HEV ORF2 基因检测

180 份粪便样本经PCR 扩增后,28 份样本扩增出189 bp 的特异性条带,与预期目的片段大小相符。将28 份阳性样本的ORF2 基因进行序列分析,经NCBI 数据库BLAST 比对发现,23 份样本为基因4 型,5份为基因3 型。 图1 为3 份代表性样品(从基因3 型和基因4 型的样本中选取)的电泳分析。 180 份粪便样本的HEV 总阳性率为15.6%(表1),其中50—60 日龄猪粪便中检测到19 份阳性,阳性率为31.7%;5—6 月龄猪粪便中检测到9 份阳性,阳性率为15.0%;母猪粪便样本中未检测到HEV 阳性。

表1 猪粪便中HEV RNA 的PCR 检测结果Table 1 PCR detection results of HEV RNA in pig feces

2.2 ORF2 部分基因序列测定及进化树分析

从28 份阳性样本中选取4 份基因4 型的样本(FX01、FX03、JS01、FX04 毒株)、1 份基因3 型的样本(FX06 毒株)扩增的ORF2 序列与GenBank 中参考毒株序列(表2)构建系统进化树(图2)。 结果表明:本试验所检测的FX01、FX03、JS01、FX04 毒株与基因4 型参考毒株SAAS-FX17 的序列同源性高达96.3%;FX06 毒株与基因3 型参考毒株SAAS-JDY5 的序列同源性高达97.9%。

表2 HEV 参考毒株的信息Table 2 Information of HEV reference strains

2.3 ORF2 基因的同源性分析

图2 HEV ORF2 基因部分毒株的遗传进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on ORF2 gene of some HEV strains

同源性分析发现,5 个毒株(FX01、FX03、FX04、FX06、JS01)的核苷酸同源性为80.9%—98.4%,其中基因4 型的4 个毒株(FX01、FX03、FX04、JS01)核苷酸同源性为96.3%—98.4%,与基因4 型参考毒株的核苷酸同源性为91.5%—96.3%;基因3 型毒株FX06 与其他4 个基因4 型毒株的核苷酸同源性为80.9%—83%,与基因3 型参考毒株的核苷酸同源性为90.4%—97.9%。

对本试验的参考毒株序列与代表性毒株序列进行核苷酸同源性分析表明:1 型组内毒株的核苷酸同源性为95.8%—100%,与2 型、3 型、4 型毒株的核苷酸同源性分别为83.6%—87.8%、84.1%—88.4%、83.6%—88.4%;2 型组内毒株的核苷酸同源性为87.3%—100%,与3 型、4 型毒株的核苷酸同源性分别为81.5%—86.8%、82.5%—86.2%;3 型组内毒株的核苷酸同源性为90.5%—100.0%,与4 型毒株的核苷酸同源性为82.0%—86.2%;4 型组内毒株的核苷酸同源性为88.4%—100.0%。

3 讨论

戊型肝炎病毒是人病毒性肝炎的重要病原之一,全球每年超过百万人感染,被世界卫生组织认定为影响发展中国家的重要公共卫生问题[15]。 动物HEV 感染宿主范围广、种类多、变异快,目前已在猪、鸡、兔、骆驼、牛、羊等动物中获得了不同动物的HEV 分离株[16]。 猪是主要的病毒储库,是人戊型肝炎的主要传染源之一,我国猪HEV 的流行情况复杂,存在感染率高、同一地点不同基因型重复污染、与多种病原共存的现象[17]。 目前,全世界范围内把HEV 分成4 个基因型,本研究团队于2007 年在上海郊区猪场首次发现我国大陆存在HEV 基因3 型毒株[18],为戊型肝炎的防控提供了重要的病原信息,而且分子流行病学调查发现HEV 的阳性率为26%[12]。 2009 年,周锦萍等[19]对上海51 个猪场1 699 份猪粪便样本进行HEV RNA 检测发现,HEV 阳性率为11.83%。

近几年,鲜有对上海地区猪HEV 感染情况的文献报道。 为了解近期上海地区猪HEV 流行情况,本研究对上海郊区的3 个猪场进行了流行病学调查,发现一个猪场的HEV 感染率为30%,且具有基因3 型和基因4 型HEV 共存的现象,3 型的感染率为5.6%,4 型的感染率为24.4%,与2008 年于水生等[20]的调查结果基本一致,基因3 型HEV 与基因4 型竞争感染中仍旧处于劣势。 另外2 个猪场各45 份样本中,只发现其中一个猪场1 份为基因4 型的HEV,另一个猪场中没有HEV 感染。 本次调查的猪场间感染率差别大,通过对猪场的管理和卫生情况调查发现,感染率低的猪场是规模化猪场,猪场管理更完善,并设有粪污处理设施,排泄物能及时清除,卫生条件较好,在一定程度上减少了易感猪群传播感染。

虽然感染猪没有明显的肝炎临床症状,但肝脏部位有不同程度的病变[21],对于相关生产指标有负面影响,给养殖业造成一定的经济损失。 猪肉是人类主要的肉食品来源之一,猪的肝脏HEV 相关抗原的阳性检出率高[21],必然会对人类的健康构成潜在威胁,应予以关注,加强猪肉、猪肝食品卫生宣传管理。 建议猪场提高管理水平,重视猪场消毒卫生及粪便的无害化处理,以降低HEV 的感染,这些措施也在本研究中零感染的猪场得到了印证。

本研究中,FX01、FX03、FX04、JS01 毒株为基因4 型,与参考毒株SAAS-FX17 的核苷酸同源性为95.2%—96.3%;FX06 毒株属于基因3 型,与参考毒株SAAS-JDY5 的核苷酸同源性为97.9%。 上述2 个参考毒株分别为本研究团队于2009 年、2012 年分离的毒株,并进行了全基因序列测定[22-23]。 同源性分析显示,本研究中的毒株与10 年前分离于上海的毒株遗传关系最近。