10 种稻田常用杀菌剂对蚯蚓的急性毒性效应

孙丽娜,黄开华,高新华,陈 伟,黄万金,吕卫光

(上海市农业科学院生态环境保护研究所,上海低碳农业工程技术研究中心,上海 201403)

近年来,进入土壤的污染物种类和数量不断增加,致使土壤的结构和功能持续恶化,部分生态系统平衡受到严峻挑战,严重威胁人类生存安全[1-3]。 相关研究表明,我国耕地受到的农药污染非常严重[4-5],目前尚未找到可以完全替代农药作用的其他产品。 因此,规避使用中高毒农药,推广低毒农药,对保障生态系统安全具有重要意义。 蚯蚓是陆生生物量最大的一类土壤动物,在土壤物理性质改良和植物营养循环方面起着重要作用[6]。 蚯蚓对多种污染物比其他土壤动物更为敏感[7],能直接或者间接反应环境污染带来的危害,也可对生态污染起到早期预警作用[8]。 利用蚯蚓指示土壤污染状况,已经成为土壤污染生态毒理诊断的一个重要指标[9]。

国内外关于农药对蚯蚓的生态毒理效应已有一些报道。 宋伟华等[10]采用人工土壤法研究了16 种农药对赤子爱胜蚓的急性毒性,发现新烟碱类农药吡虫啉、呋虫胺、噻虫胺对蚯蚓的急性毒性为中毒,其他13 种农药均为低毒。 姜锦林等[11]采用人工土壤法测定了11 种常用农药对赤子爱胜蚓的急性毒性效应,发现11 种常用农药毒性等级从高到低依次为吡虫啉>噻虫啉>克百威>毒死蜱>阿特拉津>阿维菌素>草甘膦>吡蚜酮>噻嗪酮>高效氯氰菊酯和百草枯,其中吡虫啉、噻虫啉和克百威对赤子爱胜蚓为中毒,其余为低毒。 王娟[12]研究表明,吡虫啉不但能使蚯蚓感到不适,而且可引起蚯蚓自身细胞中DNA损伤,当吡虫啉达到一定浓度时,会诱导产生DNA 交联作用。 闫轶亚等[13]研究表明,毒死蜱和对硫磷对蚯蚓的急性毒性均属于低毒。 冯磊[14]研究发现,新烟碱类杀虫剂对蚯蚓的存活率、酶系、皮肤和肠道细胞等有不同程度的损害。 潘波[15]研究了农药克百威对蚯蚓的毒性,发现蚯蚓的死亡率与土壤中的克百威含量呈正相关,将克百威归属于中等毒性农药。 已有报道都是一类或几种农药对蚯蚓生态毒理的研究,尚无对生产实际中稻田常用杀菌剂进行系统探究,因此,需要筛选对水稻有害生物高效防控、对蚯蚓和环境安全的杀菌剂种类。 威廉环毛蚓(Pheretima guillelmi)为上海稻田土壤的常见种和优势种,目前尚未有以威廉环毛蚓为材料研究农药或杀菌剂对其毒理效应的报道。 本研究拟采用人工土壤法[16]和自然土壤法[17]测定10 种稻田常用杀菌剂对威廉环毛蚓的急性毒性,探究其对蚯蚓的分子毒理学效应、剂量-效应关系等,为农田系统安全用药提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试药品

60%井冈霉素(validamycin)、10%嘧苷素(pyrimidin)、95%塞呋酰胺(thirluzamide)、40%宁南霉素(ningnanmycin)、95%己唑醇、97%甲基硫菌灵(thiophanate-methyl)、97%稻瘟灵(isoprothiolane)、40%蜡芽菌(wax bud bacteria)、98%氟环唑(epoxiconazole)、97%戊唑醇(tebuconazole)和90%三环唑(tricyclazole)均购自南京三舒生物科技有限公司。

1.1.2 供试动物

选用上海市农业科学院蚯蚓养殖实验室提供的威廉环毛蚓(Pheretima guillelmi),预养7 d,挑选2 月龄以上、体重1.5 g 左右、环带明显的健康成蚓进行试验。

1.2 试验方法

1.2.1 人工土壤法

根据OECD207 Guideline NO.207 中的标准方法配制人工土壤[16]。 试验威廉环毛蚓在不含杀菌剂的人工土壤中驯养24 h。 将杀菌剂溶于丙酮后拌入10 g 石英砂中,待丙酮挥发完全后与490 g 人工土壤混匀,加入去离子水至土壤含水量为35%。 将配制好的人工土壤放入500 mL 标准玻璃瓶中,加入10 条威廉环毛蚓,用塑料薄膜封好,并用解剖针扎孔,保证空气的流通;然后将培养皿放入温度为20 ℃、湿度为80%的恒温箱中光照培养。 供试杀菌剂设置0.1 mg∕kg、1 mg∕kg、10 mg∕kg、100 mg∕kg、1 000 mg∕kg 5 个浓度进行预试验,以确定导致威廉环毛蚓0—100%死亡率的浓度范围。 根据预试验结果,每种杀菌剂设5 个浓度,每个浓度设置3 个重复,并设置不含杀菌剂的空白对照组(蒸馏水)和溶剂对照组(丙酮)。 分别在7 d 和14 d 计数,记录威廉环毛蚓死亡数量和中毒症状,当威廉环毛蚓的前尾部对机械刺激无反应时视为死亡。

1.2.2 自然土壤法

采用未被污染的自然土壤进行试验,参考上述人工土壤法并稍加改进。 水稻收获后,从上海市农业科学院庄行基地稻田中采集深度5—15 cm 的土壤,土壤pH 6.9,有机质含量2.34%,风干后过100 目(孔径150 μm)筛备用。 试验威廉环毛蚓在不含杀菌剂的自然土壤中驯养24 h。 将杀菌剂溶于丙酮后拌入10 g 土壤中,待丙酮挥发完全后与490 g 自然土壤混匀,加入去离子水至土壤含水量为35%。 将配制好的土壤放入500 mL 标准玻璃瓶中,加入10 条威廉环毛蚓,操作同人工土壤法。

1.3 数据处理

采用SPSS 19.0 统计软件的Probit 回归方法计算杀菌剂对威廉环毛蚓的半数致死浓度值(LC50)、95%置信限、卡方值及显著性值[18]。 人工土壤法和自然土壤法测定的杀菌剂对蚯蚓的毒性分级采用《化学农药环境安全评价的试验准则》中的标准:LC50≤1.0 mg∕kg,为高毒级;1.0 mg∕kg 10.0 mg∕kg,为低毒级[19]。

2 结果与分析

本研究所设置的空白对照组和溶剂对照组在试验过程中均无死亡情况出现,蚯蚓活性较高,存活率为100%,符合试验要求。

2.1 人工土壤法

如表1 所示,随着染毒时间增长,供试杀菌剂对威廉环毛蚓的急性毒性增加。 染毒7 d 时,10 种杀菌剂对威廉环毛蚓的LC50值在13.45—322.79 mg∕kg;染毒14 d 时,10 种杀菌剂对蚯蚓的LC50值为9.79—250.68 mg∕kg。 总体来看,人工土壤法测定的每种杀菌剂对威廉环毛蚓暴露14 d 均比对其暴露7 d 的急性毒性效应高,其中嘧苷素和蜡芽菌对威廉环毛蚓的急性毒性效应增加明显。 在所测定的杀菌剂中,宁南霉素、井冈霉素、嘧苷素和蜡芽菌毒性较低,对威廉环毛蚓7 d 和14 d 的LC50值均大于100 mg∕kg;稻瘟灵的毒性最高,对威廉环毛蚓14 d 的LC50值小于10 mg∕kg,为中毒。 供试杀菌剂对威廉环毛蚓的毒性(14 d )依次为:稻瘟灵>甲基硫菌灵>戊唑醇>噻呋酰胺>氟环唑>三环唑>嘧苷素>蜡芽菌>井冈霉素>宁南霉素。

表1 人工土壤法测定10 种杀菌剂对威廉环毛蚓的急性毒性效应Table 1 Determination of acute toxic effects of 10 fungicides on P.guillelmi by artificial soil method

2.2 自然土壤法

如表2 所示,随着染毒时间增长,供试杀菌剂对威廉环毛蚓的急性毒性增加。 威廉环毛蚓染毒7 d时,嘧苷素、井岗霉素、噻呋酰胺、宁南霉素、蜡芽菌、氟环唑、戊唑醇和三环唑的LC50值在14.02—304.07 mg∕kg,甲基硫菌灵和稻瘟灵的LC50值分别为6.53 mg∕kg 和5.74 mg∕kg。 染毒14 d 时,甲基硫菌灵、稻瘟灵和戊唑醇对威廉环毛蚓的LC50值为4.10—9.65 mg∕kg,均小于10 mg∕kg,为中毒级;其余7 种杀菌剂的LC50值在30.67—244.29 mg∕kg。 总体来看,与人工土壤法测定结果相似,自然土壤法测定的每种杀菌剂对威廉环毛蚓暴露14 d,均比对其暴露7 d 的急性毒性效应高,其中戊唑醇对威廉环毛蚓暴露7 d的急性毒性为低毒级,但14 d 的LC50值小于10 mg∕kg,属于中毒级(表2)。 供试杀菌剂中稻瘟灵、甲基硫菌灵毒性较高,对威廉环毛蚓7 d 和14 d 的LC50值均小于10 mg∕kg,为中毒级;嘧苷素、井岗霉素、噻呋酰胺、宁南霉素、蜡芽菌、氟环唑和三环唑为低毒级。 供试杀菌剂对威廉环毛蚓的毒性(14 d)依次为:稻瘟灵>甲基硫菌灵>戊唑醇>噻呋酰胺>氟环唑>三环唑>嘧苷素>蜡芽菌>井冈霉素>宁南霉素。

表2 自然土壤法测定10 种杀菌剂对威廉环毛蚓的急性毒性效应Table 2 Determination of acute toxic effects of 10 fungicides on P.guillelmi by natural soil method

3 讨论与结论

蚯蚓急性毒性研究可为农药生态毒性的快速判断提供依据,为农药慢性毒性试验和田间试验设计提供参考。 因此,急性毒性试验对研究蚯蚓的生态毒理有重要作用[20]。 在农药登记与环境安全性评价中,一般采用人工土壤法作为农药对蚯蚓的急性毒性试验方法。 农药在自然环境下被土壤的胶体和有机物吸收,通过生物、光、化学氧化的分解作用,使土壤中污染物生物有效性大幅下降,污染物的吸收率下降。自然土壤法模拟蚯蚓的生存环境,试验结果贴近真实值,更能准确反映农药对蚯蚓的毒性危害[21],包括农药对蚯蚓的生存和生长发育及繁殖力的影响[22]。 徐冬梅等[17]采用滤纸接触法、人工土壤法及自然土壤法研究异丙甲草胺及其S 型对映体对蚯蚓的急性毒性,发现滤纸法的结果置信区间较大,可靠性较差,而人工土壤法和自然土壤法的结果相近,毒性等级相差不大,较为稳定。 田亚男等[23]研究了杀菌剂氟吗啉和多菌灵对蚯蚓的急性毒性,发现氟吗啉在自然土壤和人工土壤中对蚯蚓表现为低毒性,而多菌灵在自然土壤和人工土壤中的毒性等级分别是低毒级和中毒级。 可见,自然土壤与人工土壤有一定的差异,自然土壤的成分更加复杂,存在不可控因素。 以往研究多采用赤子爱胜蚯蚓[10-17],本试验采用威廉环毛蚓作为供试蚯蚓,更切合上海稻田生产实际,研究结果可为实际生产合理施药提供指导。

本研究采用人工土壤法和自然土壤法测定了10 种稻田常用杀菌剂对威廉环毛蚓的急性毒性效应,各药剂处理组威廉环毛蚓初期出现不钻土、个体较为安静等症状,后期出现局部肿大溃烂、环带膨大等症状,高浓度处理组症状尤为明显,死亡后的威廉环毛蚓身体变软,并出现不同程度的腐烂。 两种方法测得的药剂毒性从大到小均为稻瘟灵>甲基硫菌灵>戊唑醇>噻呋酰胺>氟环唑>三环唑>嘧苷素>蜡芽菌>井冈霉素>宁南霉素。 自然土壤法10 种杀菌剂染毒7 d 和14 d 的LC50值均小于人工土壤法,可能是自然土壤中的有机质含量低于人工土壤中有机质含量造成的。 本研究选择的10 种杀菌剂中,稻瘟灵、甲基硫菌灵和戊唑醇对威廉环毛蚓毒性较大,施用时需注意其对土壤生物可能的不利影响。 虽然试验中测定的其他杀菌剂对威廉环毛蚓毒性较低,低浓度暴露不会导致威廉环毛蚓的快速死亡,但蚯蚓长期接触农药会产生慢性毒性效应[24-25],有可能抑制蚯蚓的生长和繁殖。

本试验表明,10 种稻田常用杀菌剂对威廉环毛蚓都表现出一定的急性毒性效应,其中稻瘟灵、甲基硫菌灵和戊唑醇对威廉环毛蚓的急性毒性效应高于噻呋酰胺、氟环唑、三环唑、嘧苷素、蜡芽菌、井冈霉素、宁南霉素。 根据《化学农药环境安全评价试验准则》,人工土壤法测定得出稻瘟灵为中毒,其余9 种杀菌剂为低毒;自然土壤法测定得出稻瘟灵、甲基硫菌灵和戊唑醇为中毒,其余7 种杀菌剂为低毒。 在稻田施用杀菌剂时应尽可能规避中高毒杀菌剂,优先选用低毒杀菌剂。 因此,优先选用噻呋酰胺、氟环唑、三环唑、嘧苷素、蜡芽菌、井冈霉素、宁南霉素。 目前,这些低毒杀菌剂对蚯蚓的分子毒理学效应尚未明晰,不能忽略低毒杀菌剂对蚯蚓可能的慢性毒性和对环境的危害作用。 今后应进一步明确杀菌剂对蚯蚓的分子毒理学效应,以全面评价杀菌剂对蚯蚓的生态风险。