超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用在中药指纹图谱和质量评价中的应用

白东虎，贾宇荣，白春梅，武丽梅，杨芊钰

(榆林市药品检验所，陕西 榆林 719000)

质量控制一直是中药应用时需要考虑的核心问题。近年来，中药质量控制已从化学成分定性定量分析发展到整体评价阶段。不同产地、不同来源等差异和变化都会导致不同批次的药材在药用成分上存在显著的差异，单一检测手段建立的指纹图谱也越发不能满足中药质量评价的要求。因此，建立合理、准确、信息丰富的中药指纹图谱用以中药质量控制就显得尤为重要。近年来，基于超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)技术建立的中药指纹图谱以灵敏度高、稳定性好的特质成为研究人员的又一青睐对象。本文结合文献，从多方面归纳分析，以期为UPLC-Q-TOF-MS技术在中药指纹图谱研究中的应用提供参考。

1 中药指纹图谱概述

1.1 中药指纹图谱与质量评价的关系

中药，作为多组分的有机整体，化学成分复杂，若仅以一种或少数几种指标成分对其质量进行评价，不足以全面体现质量的优劣。中药指纹图谱法是指，通过对中药进行提取，采用合适的分析技术或方法对特征化学成分进行表征，进而得到体现中药整体特征的色谱或光谱图的分析方法[1]，是一种综合的、可量化的化学鉴定手段。指纹图谱所反映的化学成分信息(具体表现为相对保留时间和相对峰面积)具有高度特异性和选择性，可较充分地反映出中药复杂混合体系中各种化学成分含量分布的整体状况。尤其是在现阶段有效成分大多数没有明确的情况下，它能够结合各种色谱、光谱手段，特征性地鉴定中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”[2]。经过近些年的长足发展，中药指纹图谱研究也已由在方法和技术方面的基础研究，进入到中药质量控制和评价的实际应用中[3]。中药指纹图谱技术，作为中药材质量控制的方法，已成为一种国际共识，在中药检验、研究和中药现代化发展过程中发挥着越来越重要的作用。从2010年版开始，历版《中华人民共和国药典》的变化也可看出，指纹图谱的评价指标在不断完善，它在中药质量评价中的作用也逐渐增加[4]。

1.2 中药指纹图谱分类

中药指纹图谱按所用技术可分为化学、生物、代谢指纹图谱三大类。其中，化学指纹图谱是依据中药所含化学成分种类及含量，应用不同的仪器、方法检测得到的指纹图谱，它又可分为光谱和色谱指纹图谱。常用的光谱指纹图谱有紫外、红外、荧光、核磁共振、X射线衍射光谱等，由于这些方法能够给出药效物质基础或部分特定化学结构信息，所以它们可以作为辅助手段配合中药色谱指纹图谱的研究。得益于现代色谱技术的发展，色谱指纹图谱也成为发展最快速、应用最广泛的中药指纹图谱。常用的色谱指纹图谱技术有薄层色谱、气相色谱、液相色谱、高效毛细管电泳指纹图谱等[5]。高效液相色谱(HPLC)是指纹图谱研究中应用最广泛的方法之一，但是传统HPLC指纹图谱操作周期长、工作量大，不能完整地表征药材内在的化学质量，且多采用UV检测器，无法体现无紫外吸收的其它类成分。因此，传统HPLC指纹图谱技术用于药材质量的评价，具有一定的片面性。近年来新发展起来的UPLC-Q-TOF-MS分析技术，集UPLC高效分离能力和Q-TOF-MS/MS高分辨质谱解析能力于一体，能够快速建立指纹图谱，并能直观、综合地应用于中药质量评价分析，已逐渐成为中药活性成分和中药指纹图谱研究的最有效的分析手段之一。

2 UPLC-Q-TOF-MS技术特征

2.1 UPLC-Q-TOF-MS技术工作流程

UPLC-Q-TOF-MS技术是将超高效液相色谱(UPLC)作为色谱分离系统，将四级杆(Q)和飞行时间质谱(TOF-MS)作为质量分析器，串联而成的一种质谱技术。它的工作流程如图1所示。

图1 UPLC-Q-TOF-MS工作流程

样品经超高效液相色谱系统进样，色谱柱分离。分离流出的组分依次通过接口进入离子源(常用电喷雾电离ESI和大气压化学电离APCI两种离子源)，经由离子化形成离子，经过四级杆离子光学系统的调节形成可控离子束进入飞行时间质量分析器。离子束被垂直引入加速区加速，进入漂移区，经过二级反射镜后再返回。在第二级质量分析器进行质谱分离后，分别在检测器上产生信号，然后经过信号转换输出色谱-质谱二维谱图[6]。最后经过数据处理系统分析所采集的数据信息，根据产生并收集到的离子特征对化合物进行定性和定量分析。

2.2 UPLC技术特点

UPLC是质谱检测器的最佳液相色谱入口之一。UPLC系统达到最佳线速度时(一般在0.25～0.50 mL/min)，与质谱能承受的流速(API接口 0.20 mL/min)更加匹配，使得离子化效率提高。此外，UPLC是应小粒径填料(粒径<2 μm)和超高压(压力> 105kPa)要求而专门设计的[7]，保持了传统HPLC的基本原理(理论依据仍源于范迪姆特(VanDeemter)经验方程)，但其分离效能和分离速度得到极大提高,可以显著改善色谱峰的分离度、检测灵敏度，并缩短分析周期，同时减少了流动相用量从而降低分析成本。

2.3 Q-TOF-MS技术特点

四级杆质量分析器(Q)，由直流和射频交流电压叠加的四极电场构成，通过设定参数可使特定质荷比(m/z)的离子稳定通过，其它离子则以不稳定的运动碰到四级杆上被吸滤掉。四级杆具有优良的离子过滤能力，因此又叫四级杆滤质器[8]。

飞行时间质量分析器(TOF-MS)主要由一个离子漂移管构成，工作原理是基于动能相同而质荷比(m/z)不同的离子在恒定电场中经过恒定距离所需时间不同，进行质谱分离。进行二级质谱分析时，第一重四级杆选择母离子。加速至一定能量后进入只有射频的四级碰撞室与惰性气体碰撞而碎裂成子离子。这些子离子再经过加速和聚焦进入飞行时间质量分析器，按照质核比大小进行分离[9]。飞行时间质谱的优势在于扫描范围宽(50～40000 m/z)，能得到物质准确相对分子质量，并通过精确质量数和同位素峰形进行数据库检索比对，可快速地对目标化合物和未知化合物实现精确定性[10]。

总之，UPLC-Q-TOF-MS技术极大的发挥了两种高性能分析仪器的优点。UPLC的特点是分离效果好、分析速度快，而Q-TOF-MS选择性强、灵敏度高，且有正负离子两种模式，可以将无法色谱分离的组分实现质谱分离，还可以精确检测相对分子质量，其产生的二级质谱能提示特征离子碎片信息[11]，这些信息结合已知结构化合物的裂解等规律，能对未知成分进行定性、定量分析，这恰好能满足中药指纹图谱研究的需要。

3 UPLC-Q-TOF-MS技术在中药材指纹图谱研究和质量评价中的应用

结合近期文献发现，UPLC-Q-TOF-MS技术在中药材指纹图谱研究和质量评价中的作用主要体现在指纹图谱中共有峰的指认及鉴定上，包括鉴别已知和未知化学成分。文献多应用UPLC或HPLC建立中药材指纹图谱，并利用相似度评价技术或主成分分析技术(PCA)快速辨别主成分峰和差异峰；然后利用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱采集总离子流色谱图；接着对色谱图中的各个色谱峰进行精确质量数识别，并结合保留时间表征中药材中的化学成分；然后通过对照品比对指认、文献比对，以及高分辨质谱数据解析等方法，根据精确质量数及同位素推算出分子式，进而结合二级质谱及文献资料分析鉴定中药材化学成分；最后给出分析结论以指导中药材质量控制。

3.1 建立中药材指纹图谱并分析化学成分

张玉等[12]建立了合欢花药材的UPLC特征指纹图谱，并基于UPLC-Q-TOF-MS技术快速鉴别了合欢花中的主要化学成分，共标示出5个共有峰，各共有峰相对保留时间，RSD均<2%，经过质谱指认、定性分析共鉴定出多个化合物。刘宏等[13]基于UPLC-Q-TOF-MS技术建立了23批不同产地胡桃楸根药材指纹图谱，通过相似度评价和主成分分析，并根据化合物的精确分子量和碎片信息，结合文献数据鉴定了其中的化学成分，为胡桃楸根的质量评价奠定了基础。吴惠勤等[14]采用UPLC-Q-TOF-MS技术，构建了沉香数字化色谱-质谱指纹图谱，共鉴定出沉香中30个化学成分。赵倩等[15]建立了掌叶大黄UPLC指纹图谱采集方法，并基于UPLC-Q-TOF-MS技术通过对照品指认、文献比对及高分辨质谱数据解析对掌叶大黄的化学成分进行全面定性分析。曹瑞等[16]利用类似技术方法建立了35批大黄饮片指纹图谱，并生成对照指纹图谱，标定共有峰45个，结合相似度评价技术建立了大黄饮片质量评价方法。

3.2 评价不同来源不同产地中药材质量

叶耀辉等[17]采用UPLC-Q-TOF-MS技术在 35 min内建立了不同产地北柴胡药材的指纹图谱，并通过质谱数据处理软件、代谢组学分析软件对其进行主成分分析，该法能快速全面地区分不同产地北柴胡药材中化学成分的差异，评价北柴胡药材质量的优劣。李丹丹等[18]采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件建立了30批大黄药材(掌叶大黄20批、唐古特大黄和药用大黄各5批)的HPLC指纹图谱并进行相似度评价，采用偏最小二乘判别法结合UPLC-Q-TOF-MS技术定性鉴别3种来源大黄的差异性成分，该法可有效区分3种不同来源大黄药材，为多来源药材的鉴别和质量评价提供了参考。张藏蔓等[19]建立了野生、组织培养和种植等14批不同来源金线莲药材超高效液相色谱-飞行时间质谱指纹图谱，并基于UPLC-Q-TOF-MS含量测定方法，从中指认出36个化学成分，结合指纹图谱相似度考察、聚类分析及含量测定表明对药材中化学成分种类及含量产生显著影响的因素为产地和栽培时间。

此外，何席呈等[20]运用UPLC-Q-TOF-MS技术，建立了土茯苓基于内标校正的质谱指纹图谱共有模式，反映了贵州产地域性药材土茯苓的内在质量。冯光维等[21]采用UPLC-Q-TOF-MS技术，建立了不同产地12批地锦草的UPLC指纹图谱，通过对照品比对指认了16个共有峰中的6个共有峰，表明地锦草在同一地域中的品质差异较小，质量稳定。陈菲、芮雯等分别运用UPLC-Q-TOF-MS技术建立指纹图谱，完成了对不同批次樟芝菌粉和7个产地黄芪药材的质量评价[22-23]。

3.3 评价炮制机制对中药材化学成分的影响

崔美娜等[24]应用UPLC-Q-TOF-MS技术，对半夏多物料多流程不同阶段炮制品进行了研究分析，通过对总离子流指纹图谱进行分析，根据色谱保留时间、一级精确质荷比、二级的碎片数据，同时结合相关文献、数据库以及质谱裂解规律，对主要色谱峰的来源进行了归属，发现半夏炮制前后化学成分存在明显差异，为探究半夏多物料多流程炮制机制提供一种新的策略。蔡萍等[25]采用指纹图谱结合化学计量学对23批不同来源蜜炙百合与生百合质量进行评价，基于UPLC-Q-TOF-MS技术和随机森林算法对差异峰进行鉴别，发现王百合苷D和B对准确分辨炮制过的蜜炙百合和生百合具有重要贡献。

3.4 中药材真伪鉴别方面的应用

钟惠娴等[26]应用UPLC-Q-TOF-MS技术快速、准确地鉴别了防风和水防风的差异化合物，改法可用于防风指纹图谱数据的快速分析，在防风和水防风性状极易混淆的情况下，该技术结合薄层色谱鉴别法能判别防风药材的真伪。

4 UPLC-Q-TOF-MS技术在中药复方制剂指纹图谱研究和质量评价中的应用

复方制剂质量评价一般遵循整体的概念。基于UPLC-Q-TOF-MS技术，对中药复方制剂的化学成分进行分析鉴别，原理上类似于对中药材化学成分的分析，区别是分析鉴别完成后对主要化学成分进行药材归属，从而阐明不同药材对复方化学成分的贡献。近年来，应用UPLC-Q-TOF-MS技术建立并分析中药复方制剂指纹图谱，结合天然产物化合物-高分辨质谱数据库，并运用大数据对比分析，可以快速指认出中药复方制剂化学成分及其药材的归属，成为一种重要的中成药制剂质量评价方法。

黄广伟等[27]采用UPLC-Q-TOF-MS在正、负两种离子模式扫描下，建立指纹图谱，通过天然产物高分辨质谱数据库结合对照品比对，从芩苏胶囊中共检测到68个化学成分，鉴定出22个化学成分，并分析出芩苏胶囊中6个黄酮类成分来源于黄芩，3个酚酸和3个二萜醌类成分来源于丹参，3个黄酮和5个生物碱类成分来源于苦参，1个酚酸类成分来源于紫苏子；发现黄酮、酚酸、二萜醌及生物碱4类成分构成了芩苏胶囊的物质基础。崔璐等[28]基于UPLC-Q-TOF-MS技术研究了不同厂家前列癃闭通片指纹图谱，并对各样品的指纹图谱进行相似度评价，结合聚类分析评价了9个厂家58批样品的质量，指认了指纹图谱中主要共有峰的化学成分并确定了其药材归属。吴琦等[29]基于该技术鉴定抱龙丸中的化学成分并建立指纹图谱，最终通过软件预测及文献数据,从抱龙丸中鉴定出46个成分，为抱龙丸的质量标志物筛选、药效物质基础和质量控制研究提供了参考。马莹等[30]运用该技术建立指纹图谱并分析发现桂枝茯苓胶囊中三萜酸类成分主要来自于茯苓药材。李睿等[31]采用UPLC-Q-TOF-MS技术分析了复方汤剂麻黄汤水提取部分的化学成分。罗艺等[32]运用UPLC-Q-TOF-MS技术对治咳川贝枇杷滴丸的醇提物分析表征并建立指纹图谱，通过相似度分析，表明不同批次滴丸的质量差异较小。

5 UPLC-Q-TOF-MS技术在谱效关系研究中的应用

将中药指纹图谱与药效学试验有机结合，研究谱效关系，能揭示出中药发挥药效的物质基础以及建立中药质量评价标准。谱效关系是指纹图谱研究的高级阶段，中药谱效关系研究常采用化学计量学的方法，建立中药指纹图谱与药效作用之间的相关性，通过相关性分析可以更加全面地对中药质量进行控制与评价。整体思路是采用一定的分析方法建立中药指纹图谱，并研究其中的化学成分，建立适宜的药效评估模型，并获得相应药理数据，通过适宜的数据处理技术对相应的指纹图谱数据及药理结果进行相关性分析从而建立起谱效关系模型[33]。近年来，已有不少文献报道借助UPLC-Q-TOF-MS技术建立中药指纹图谱，然后选择合适方法对指纹图谱中各共有峰与药效指标的相关性进行分析，进而揭示中药发挥药效的物质基础以及建立中药质量评价标准。

程斌等[34]借助UPLC-Q-TOF-MS，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》建立了10批不同产地浙贝母的指纹图谱，以小鼠耳肿胀度和血清中丙二醛、一氧化氮水平为药效指标，采用双变量相关分析法和灰色关联度分析法对UPLC-Q-TOF-MS指纹图谱中各共有峰与抗炎药效指标的相关性进行分析，从而筛选出贝母素乙、贝母素甲、环巴胺等可能是浙贝母具有抗炎作用的质量标志物。周姣姣等[35]利用UPLC-Q-TOF-MS，通过标准品比对和文献检索对美洲大蠊提取物CⅡ-3所含化合物进行分析鉴定，以CⅡ-3对人肝癌细胞HepG2的半抑制浓度为抗肝癌活性指标，采用灰色关联度分析法和正交偏最小二乘法联合建立指纹图谱与抗肝癌活性之间的谱效关系，初步阐明了美洲大蠊提取物CⅡ-3体外抗肝癌的活性物质，为该药的物质基础研究和临床应用提供了实验依据。

6 UPLC-Q-TOF-MS技术应用建议

UPLC-Q-TOF-MS技术的出现使得中药指纹图谱的研究更加便捷、高效，也使得中药的严格质量把控逐渐成为可能，依靠现代数据处理软件和工具，极大地方便了分离组分质谱的解析，使推测物质成分和结构特征变得相对容易。未来中药分析技术必将是相互交叉、配合使用的，所以笔者认为，未来该技术应用着眼于以下几方面会更加凸显优势。

1)结合新兴的前处理技术和其他分析技术

作为对待测组分提取、富集和纯化的样品前处理步骤，关系着整个分析方法的优劣，还决定着分析结果的准确性和重现性[36]，未来UPLC-Q-TOF-MS技术只有结合适当的中药前处理技术使用，才能发挥出更大优势。近年来出现的许多高效、快速和微量化的前处理技术，如固相微萃取、超临界流体萃取等，必将在与UPLC-Q-TOF-MS技术的配合应用中起关键作用。此外，未来UPLC-Q-TOF-MS技术结合核磁共振、X射线衍射、圆二色谱等辅助分析技术，更能发挥该技术在中药分析中的定性定量优势。

2)结合质谱大数据库配合软件分析

中药的液质数据库信息量大，包含非常多的化学成分信息，并且质谱解析需辅以一定的专业知识，这些导致了液质的数据信息不能被很好地挖掘[37]。如果将UPLC-Q-TOF-MS技术与数据库技术结合，并配合先进分析软件辅助中药成分鉴定，便可以更充分地挖掘液质数据信息，进一步提高定性鉴别效率，这将是该技术未来应用的一大趋势。这点在近些年的中药分析研究中也常有体现，借助UPLC-Q-TOF-MS技术建立一级精确质量数以及二级碎片离子质谱图数据库，实现一次进样，便可以对多种已知和未知化合物进行全面筛查分析。

3)中药指纹图谱谱效关系有待进一步深入研究

目前，常用的相似度等评价方法所评价的化学成分并非完全是活性成分或与药效相关的成分，仅能鉴定中药材的真实性，而不能对中药材的有效性进行评价[38]。将化学指纹图谱所体现的化学成分与药效信息建立相关性的谱效关系研究，是传统化学指纹图谱的有效补充，目前这方面研究略显欠缺。未来期望有更多的研究者利用UPLC-Q-TOF-MS技术开展这方面的研究工作，以期更好的推动中药谱效关系研究。

总之，相信随着UPLC-Q-TOF-MS技术应用的深入和现代分析技术的更新发展，未来必然会出现更多元、更多级的串联质谱法。该类技术也会朝着更高效、更准确、更智能化方向发展，该类技术在中药指纹图谱研究和中药质量评价中也将发挥越来越重要的作用。