氯沙坦缓解术前焦虑诱发的术后痛敏和抑制小胶质细胞活化 *

临床上，外科手术病人术前常会因多种应激刺激而产生不同程度的焦虑情绪，其发生率可高达40%

。术前焦虑会加重术后疼痛，甚至促进术后急性疼痛向慢性疼痛发展

，进而影响术后病人预后和转归，是一个亟待解决的临床问题。目前临床常用广谱抗焦虑药来缓解术前焦虑，但这些抗焦虑药会存在严重不良反应，如嗜睡、情绪低落、胃肠反应等。因此研究术前焦虑加重术后疼痛的神经分子机制及有针对性的靶向防治策略，对于促进病人术后恢复，提高病人术后的生活质量具有极其重要的意义。

近期的研究结果显示，应激可以直接影响脊髓水平疼痛相关信号分子的表达和活化

。我们的前期研究结果表明应激会增强脊髓水平的神经炎症反应，表现为小胶质细胞活化并表达、释放促炎性因子如白细胞介素-1β (interleukin-1β, IL-1β) 和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)

。这些炎性介质作用于神经元相应受体，导致神经元对于疼痛信号的异常反应，引起痛觉过敏及中枢敏化

。这可能是应激加重术后疼痛的机制之一，而抑制小胶质细胞介导的促炎性反应可能会有潜在治疗作用。

最新的研究证实，肾素-血管紧张素系统 (reninangiotensin system, RAS) 可以调控机体的炎症免疫反应

，其主要通过血管紧张素II (angiotensin II,Ang II) 及其血管紧张素II 1 型受体 (angiotensin II type 1 receptor, AT1R) 结合而发挥作用。Ang II 是一种应激相关激素，应激状态下循环系统中Ang II 会显著升高。Ang II 不能通过血脑屏障，但研究发现中枢神经系统存在独立的RAS，在脑和脊髓中以及神经胶质细胞上均有AT1R 表达

。我们的前期研究显示，应激可以引起大鼠脊髓中Ang II 水平升高

。Bhat 等

的离体实验提示Ang II 可以通过与小胶质细胞上的AT1R 结合而发挥免疫调控作用，拮抗AT1R 可抑制炎症反应。但抑制AT1R 是否能够缓解术前焦虑应激诱发的术后痛觉过敏目前尚不清楚。

2013年1月份以来，我国中东部各地陆续出现大范围和长时间的雾霾天气，全国多地空气显示“重度污染”，严重威胁着人们的健康和生活。雾霾天气引发了社会各界对我国粗放型经济增长模式的质疑，传统GDP核算方式也面临着巨大的挑战。从一定程度上来说，雾霾天气是长期以来我国各地方政府片面追求GDP增长，忽视对环境的监测和治理，以牺牲环境为代价取得经济快速增长的结果。这种粗放型的经济增长模式满足了人们当前的利益需求，但是从长期来说，将对环境和生态造成严重的影响，使得环境污染不断加剧，严重影响人们赖以生存的环境。因此，实施绿色GDP核算体系势在必行。

本研究首先给予SD 大鼠单次延长应激 (single prolonged stress, SPS) 引起焦虑样行为后，再进行大鼠右后足切口术，以建立术前焦虑应激诱发术后痛觉过敏的动物模型

；然后基于该模型观察鞘内注射AT1R 拮抗剂氯沙坦对大鼠疼痛行为以及脊髓小胶质细胞和促炎性因子的影响，探讨AT1R 是否为潜在的镇痛靶点。

将大鼠放入底部是金属网格的有机玻璃箱（长20 cm，宽25 cm，高15 cm）内适应30 min，待其安静后用电子

Fery 探针（美国IITC 公司）刺激右侧足底中部，施加的压力匀速增加，记录大鼠缩足时压力。测定3 次，每次至少间隔5 min，取3次测定结果的平均值即为MWT。

1．研究对象：收集青岛大学医学院附属医院消化内科2011年1月至2016年4月间收治的GEP-NEN患者36例，其中男性26例，女性10例，年龄18～81岁，平均(53±14)岁。肿瘤位于胃10例，肠道10例(其中直肠9例，小肠1例)，胰腺16例。根据2013年中国胃肠胰神经内分泌肿瘤病理诊断共识[3]的肿瘤病理分级标准，G1级14例，G2级10例，G3级12例。本研究通过医院伦理委员会批准。

方 法

1. 实验动物

清洁级成年雄性SD 大鼠，体重200～250 g，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供，所有大鼠购入后在实验环境下适应1 周。饲养室及行为学实验室温度均保持在21℃±1℃。湿度保持在50%～60%。所有实验均经华中科技大学同济医学院附属同济医院动物伦理和使用委员会批准。

2. 实验分组

用免疫荧光法对Iba-1（小胶质细胞标记物）进行染色来检测脊髓背角小胶质细胞的活化情况。图3A 显示各组大鼠脊髓背角Iba-1 的染色情况。图3B 为Iba-1 阳性细胞比例的定量分析结果。结果显示：与Control 组相比，Incision 组及SPS + incision 组大鼠术后脊髓Iba-1 阳性细胞的比例均较高（

＜ 0.05，见图3B）；与Incision 组相比，SPS +incision 组大鼠术后脊髓Iba-1 的荧光强度较高（

＜0.05，见图3B）。

第二部分实验：24 只SD 大鼠采用随机数字表法随机分为3 组：Control 组（对照，不做任何处理）、Incision 组（行切口术）和SPS + incision 组（先行SPS，1 天后行切口术），每组8 只。分别于切口前2 天、切口后2 h、6 h、24 h、48 h 进行机械缩足反射阈值 (mechanical withdrawal threshold,MWT) 测定；最后一次行为学测定后大鼠在深麻醉后处死，3 只进行免疫荧光染色，5 只进行RT-PCR检测。

政治生态是一个地方政治生活现状以及政治发展环境的集中反映，是党风、政风、社会风气的综合体现。政治生态不是朦胧含混、虚无缥缈的，它同自然生态一样是可透视、可检查、可量化的。为此，我们设置了科学的指标体系，标明了可衡量、可评价的尺度。

第三部分实验：24 只大鼠采用随机数字表法随机分为3 组：Control + vehicle 组（鞘内注射0.9%氯化钠溶液）、SPS + incision + vehicle 组和SPS +incision + LOR 组（鞘内注射氯沙坦100 nmol，英国Tocris 公司），每组8 只。各组大鼠鞘内给药或溶剂体积均为10 μl，鞘内注射氯沙坦剂量为100 nmol，注射时间为SPS 前30 min 及切口前30 min 或对应时点；分别于切口前2 天、切口后2 h、6 h、24 h、48 h 进行MWT 测定；最后一次行为学测定后大鼠在深麻醉后处死，3 只进行免疫荧光染色，5 只进行RT-PCR 检测。

3. SPS 模型的建立

参照Liberzon 等

的方法建立SPS 模型。首先使用动物束缚器将大鼠束缚2 h，之后立即将其置于高60 cm、直径25 cm 的容器中（水温24℃、水深40 cm）进行20 min 的强迫游泳，休息15 min后将其麻醉至深昏迷。最后将大鼠置于通风干燥处待其苏醒后放入笼中。

4. 切口痛模型的建立

参考Brennan 等

的方法进行。将大鼠七氟醚麻醉后仰卧位固定，使用碘伏消毒大鼠的右侧后爪并铺常规手术洞巾。用11 号刀片在右后爪距离脚后跟0.5 cm 处，向趾部行长约1 cm 的纵向切口，将足底肌肉用眼科镊挑起并做纵向切割，在此过程中保持肌肉的起止及附着的完整性。压迫止血后，用缝合线将皮肤缝合。

如有学者指出：单向的政府主导的普法模式与大众需求之间已经出现了期望与效果反差巨大的问题。一方面，政府从概念、制度和行动过程中过于强调政府主导和国家立场，鲜少顾及公民的法律需求，久而久之，这种“政府主导型”普法模式逐渐演变为“一厢情愿”的“独白”。另一方面，公民缺乏法权意识，在民间启蒙和维权活动中显然没有一个清晰的法制概念，特别是在法制建设早期，公民与政府极少有互动。

此外，较之于其它教学模式，基于“工作室制”的教学模式在其成员组成方面有其独特性，不同年级的学生以工作室制为单位参与创作，这打破了班级授课制的限制，更加类似于“五龄组”(同龄和上下两岁年龄)人员构成[6]。“五龄组”人员构成模式也是教育学上所追求的的较为理想的状态，在“五龄组”组成的团体内，其互动和博弈的丰富程度远超同龄组团体。正是由于在“五龄组”团体中，成员间的知识面更加丰富、知识掌握程度也不同，更利于同辈学习的开展，同时工作室中的骨干成员在一定条件下也能担负起“导师”的职责。

5. 鞘内给药

按照Mestre 等

的方法进行。将大鼠置于操作台上，背部剪毛并用碘伏消毒后用微量注射器于L

椎间隙垂直缓慢进针，当大鼠出现甩尾动作时提示鞘内穿刺成功，固定微量注射器针头后将相应药物或溶剂注射入鞘内，注射时间控制在10 s 左右。

6. 焦虑样行为检测

以上结果表明，SPS 可以增强切口大鼠脊髓小胶质细胞的活化和促炎性因子表达的上调。

Tassorelli C, Grazzi L, de Tommaso M, et al. Noninvasive Vagus Nerve Stimulation as Acute Therapy for Migraine. The Randomized PRESTO Study. Neurol, 2018, 91(4): e364-e373.

7. MWT 测定

在审美如何通达政治方面，西方马克思主义代表人物雅克·朗西埃的著作《美感论》中探讨了十四个事件，如对温克尔曼笔下赫拉克勒斯残躯的分析，“《残躯》的外表让我们看出，它既像是在对自己这幅英雄躯体完成的伟业作着回想，又像是在波浪一般的起伏涨落中对一切已经无动于衷，这座雕像上已经有了改换不停的各种身体，它就像是这样把多重外表融为一层，把多个身体化作一个，是这样而来的紧张状态让它产生了美”[3]19。朗西埃由赫拉克勒斯残躯的外在形式，看到这一雕像的极致之美，及其背后艺术审美体制的历史变迁。

8. 免疫荧光染色

大鼠在深麻醉后处死，经心脏灌注4%多聚甲醛进行固定后将大鼠脊髓L

-L

节段快速取出体外固定24 h。将标本在30%蔗糖缓冲液中脱水72 h 后，使用冰冻切片机将脊髓切成20 μm 厚的切片。切片用10%山羊血清和0.3% Triton X-100 封闭后，在含有山羊抗Iba-1（英国Abcam 公司）中4℃孵育过夜。之后将脊髓切片与Alexa Fluor 488 标记的荧光二抗（美国Invitrogen 公司）在室温下孵育2 h，干燥后加入含DAPI 的抗荧光淬灭封片液进行封片。在Leica TCS SP2 荧光显微镜（德国Leica 公司）下观察并记录右侧脊髓背角图像。每组选取5 张切片，采用ImageJ 软件计算Iba-1 阳性细胞的比例。

9. RT-PCR

大鼠在深麻醉后处死并将脊髓L

-L

节段取出。将右侧脊髓分离后使用Trizol 提取液提取总RNA，并通过分光光度计定量。使用PrimeScript RT Reagent Kit（日本Takara 公司）将分离的RNA 转录成cDNA。使用SYBR Premix ExTaq Kit（日本Takara 公司）在 Applied Biosystems StepOne™系统（美国(Applied Biosystems 公司）上进行定量PCR。引物序列：IL-1β，上游：5'-TGACCTGTTCTTTGAGGCTGAC-3'，下游：5'-CATCATCCCACGAGTCACAGAG-3'；TNF-α，上游：5'-CTTCTGTCTACTGAACTTCGGGGT-3'，下游：5'-ATCTGAGTGTGAGGGTCTGGGC-3'；GAPDH，上游： 5'-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3'，下游：5'-CATGAGGTCCACCACCCTGTT-3'。扩增反应条件：95℃预变性10 min，随后95℃变性15 s，60℃退火延伸1 min，40 个循环。以循环阈值（Ct 值）作为统计参数，GAPDH 为内参，采用2

法进行数据分析。

10. 统计学分析

结 果

1. SPS 对大鼠焦虑样行为的影响

与Control 组相比，Incision 组和SPS + incision组大鼠术后2 h 至48 h 的MWT 均降低（

＜ 0.05，见图2）；与Incision 组相比，SPS + incision 组大鼠术后6 h 至48 h 的MWT 均降低（

＜ 0.05，见图2）。

2. SPS 对切口大鼠MWT 的影响

与Control 组相比，SPS 组大鼠在高架十字迷宫放方臂的探索次数占比（

＜ 0.05，见图1A）和探索时占比（

＜ 0.05，见图1B）均降低，表明SPS 可以诱发大鼠产生焦虑样行为。

3. SPS 对切口大鼠术后脊髓小胶质细胞活化和促炎性因子表达的影响

第一部分实验：16 只SD 大鼠采用随机数字表法随机分为2 组：Control 组（对照，不做任何处理）和SPS 组（行SPS 处理），每组8 只。1 天后行高架十字迷宫 (elevated plus maze, EPM) 实验测定焦虑样行为。

用RT-PCR 检测大鼠脊髓IL-1β 和TNF-α mRNA水平。结果显示：与Control 组相比，Incision 组及SPS + incision 组大鼠术后脊髓IL-1β（

＜ 0.05，见图3C）和TNF-α mRNA（

＜ 0.05，见图3D）均上调；与Incision 组相比，SPS + incision 组大鼠术后脊髓IL-1β（

＜ 0.05，见图3C）和TNF-α mRNA（

＜0.05，见图3D）均上调。

采用高架十字迷宫EPM 实验进行

。迷宫由一对开放臂（长60 cm，宽10 cm）和一对闭合臂（长60 cm，宽10 cm，高40 cm）组成，四个臂交叉组成十字形，在交叉处形成10 cm

的中央区域以供大鼠放置，迷宫距地面40 cm。检测开始时，大鼠头朝开放臂放置于中央区，之后开启摄像监控器，记录大鼠5 min 内的行为并进行计算如下参数：开放臂进入次数百分比 =（开放臂进入次数/进入的总臂数）×100%；开放臂停留时间百分比 =（开放臂停留时间/总停留时间）×100%。

4.鞘内注射氯沙坦对SPS 复合切口大鼠痛行为学的影响

与溶剂相比，鞘内注射氯沙坦可以升高SPS +切口大鼠术后2 h 至48 h 的MWT（SPS + incision +vehicle

SPS + incision + LOR；

＜ 0.05，见图4）。

5.鞘内注射氯沙坦对SPS 复合切口大鼠脊髓背角小胶质细胞活化及促炎性因子表达的影响

图5A 显示各组大鼠脊髓背角Iba-1（小胶质细胞标记物）的免疫荧光染色情况。图5B 为Iba-1 阳性细胞比例的统计结果。结果显示：与溶剂相比，鞘内注射氯沙坦可以降低SPS 复合切口组大鼠术后脊髓Iba-1 阳性细胞的比例（SPS + incision + vehicle

SPS + incision + LOR；

＜ 0.05，见图5B）。用RT-PCR 检测大鼠脊髓IL-1β 和TNF-α mRNA水平。结果显示：与溶剂相比，鞘内注射氯沙坦可以降低SPS 复合切口组大鼠脊髓IL-1β（SPS + incision + vehicle

SPS + incision + LOR；

＜ 0.05，见图5C）和TNF-α mRNA（SPS + incision + vehicle

SPS + incision + LOR；

＜ 0.05，见图5D）的上调。以上结果表明，鞘内注射氯沙坦可以抑制切口大鼠脊髓小胶质细胞的活化和促炎性因子表达的上调。

1.1 一般资料 选取陕西省人民医院ICU 2016年6月至2017年5月收治的脓毒症患者82例为研究对象。诊断标准符合国际脓毒症会议制定的脓毒症诊断治疗标准[3]。排除标准：人类免疫缺陷病毒感染(血清HIV抗体阳性)；口服糖皮质激素类药物超过1个月；入组后24 h内死亡，因各种原因放弃治疗及不同意参加本研究者。

讨 论

多种生理或心理应激刺激均可以影响中枢神经系统痛觉传递的相关通路，导致机体对疼痛敏感性增加，这种现象被称为应激诱发的痛觉过敏(stress-induced hyperalgesia, SIH)

。SPS 是一种经典的应激模型，可以诱发焦虑样行为。本研究显示在SPS 后行切口手术，大鼠机械痛阈值显著降低，提示模型制备成功。

在疼痛信号传导通路中，脊髓是伤害性信号传递和整合的初级中枢。脊髓水平的神经免疫反应失调在疼痛的发生、发展过程中发挥重要作用。小胶质细胞作为中枢神经系统定居的免疫细胞在该过程中的作用也被广泛证实。来自外周传入神经的伤害性信号以及相关介质会导致小胶质细胞聚集并由静息状态转化为促炎性状态，促进其合成并释放促炎性因子（如IL-1β 和TNF-α 等）。这些促炎性因子通过作用于神经元上相应受体，会增加兴奋性突触神经传导和/或降低抑制性神经传导，从而引起痛觉过敏及中枢敏化

。在神经病理性疼痛、骨癌痛等多种慢性疼痛模型以及切口术后急性疼痛模型中，脊髓小胶质细胞均处于高活化状态并伴随促炎性因子的表达上调

。近期的研究显示应激可以直接影响脊髓水平疼痛相关信号分子的表达和活性。脊髓水平谷氨酸、γ-氨基丁酸等神经递质的释放

以及蛋白激酶Cγ

、Toll 样受体4

等的表达在多种应激刺激下均可发生变化，并参与SIH 的形成。应激可以影响小胶质细胞的活化。除了短暂引起小胶质细胞促炎性因子释放外，应激刺激还可以将神经免疫微环境转变为促炎状态，使小胶质细胞对后续的炎性刺激产生更强的反应，这一作用被称为敏化或启动

。本研究结果显示，与单纯切口相比，应激处理的大鼠切口术后疼痛加重，并伴随脊髓小胶质细胞活化增强和促炎性因子（IL-1β 和TNF-α）表达增加。该结果提示应激引起的小胶质细胞敏化参与了SIH 的形成。

传统的RAS 存在于循环系统，主要通过血浆中的Ang II 与血管组织上的相关受体（主要为AT1R）结合发挥收缩血管、调节血压和水钠平衡等作用

。除了循环系统中的RAS，机体一些器官和组织中也存在局部的RAS（如心脏、肾脏、胰腺和脂肪组织），这些部位含有构成RAS 的各种酶和受体

。另外，单核巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞等免疫细胞也表达AT1R。Ang II 以自分泌或旁分泌的形式与这些免疫细胞上的AT1R 作用，促进免疫细胞活化增殖并增强其免疫功能，进而参与炎症免疫反应

。虽然Ang II 不能通过血脑屏障，但研究发现中枢神经系统存在独立的RAS

。神经胶质细胞可以合成血管紧张素原。同时，中枢神经组织中也存在肾素和血管紧张素转化酶等促进Ang II 生成的酶，生成的Ang II 可以通过与胶质细胞上的AT1R 结合而发挥免疫调控作用

。既往的研究证实，活性升高的Ang II-AT1R 与多种以炎性反应增强为主要病理表现疾病的形成有关（如类风湿关节炎、多发性硬化、阿尔茨海默病等）。使用血管紧张素转化酶抑制剂或AT1R 拮抗剂则可以对这些疾病产生治疗作用

。拮抗AT1R 在神经病理性疼痛及炎性痛模型中均显示出镇痛作用

。与这些研究结果一致，本研究结果表明鞘内注射AT1R 拮抗剂氯沙坦也可以缓解应激诱发的切口术后痛觉敏化。

本研究结果显示鞘内注射氯沙坦会伴随脊髓小胶质细胞活化降低和促炎性因子表达下调。Bhat等

的离体实验结果显示，小胶质细胞上AT1R激活后会引起胞内NFκB 活性增强并伴随促炎性因子合成释放增多。进一步研究提示丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinase, MAPK) 信号通路家族可能介导了AT1R 的这一作用：AT1R 拮抗剂可以显著降低人血管内皮细胞中细胞外信号调节激酶 (extracellular signal-regulated kinase, ERK) 通路转录后的信号调节

；在星形胶质细胞中激动AT1R 可以引起胞内p38 MAPK 的磷酸化

。基于以上证据，我们推测氯沙坦的镇痛作用可能通过阻断小胶质细胞上的AT1R 从而抑制促炎性反应而实现。但AT1R 调控小胶质细胞促炎性因子合成释放的具体机制还需进一步研究。另外，星形胶质细胞以及神经元上也有AT1R 表达，因此氯沙坦也可能通过作用于这两类细胞而发挥作用，但还需进一步研究证实。

综上所述，鞘内注射氯沙坦可以缓解应激诱发的切口术后痛觉敏化，该作用可能通过阻断小胶质细胞上的AT1R 从而抑制炎性反应而实现。本研究结果提示AT1R 可能是SIH 潜在的治疗靶点。但值得注意的是，AT1R 拮抗剂是重要的抗高血压药，全身用药会伴随血流动力学的变化，因此AT1R 拮抗剂用于缓解疼痛的合理给药途径仍需进一步探究。另外，AT1R 调控小胶质细胞及促炎性因子合成的具体机制还需体外细胞实验来详细阐明。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。

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