一种联萘酚亚胺衍生物的荧光增强型 锌离子探针

宁东元，李海强，韦正，潘立卫，黄秀香

(河池学院化学与生物工程学院，广西 宜州 546300)

0 引言

锌在人体中属于微量元素，但是从承担的生理功能来看，锌在维持人的机体正常运转方面扮演着重要角色[1-2]：锌离子是人体许多重要蛋白或辅酶的组成部分，如碳酸酐酶和锌指蛋白；更有着“智力元素”和“生命之花”的美誉，调控人的大脑发育和生殖功能。但是人摄入过量的锌后会打乱锌与铜、铁、硒等其他微量元素的动态平衡[3]，引起心脑血管疾病和抵抗力下降，同样不利于健康。由于汽车和电池工业的日益发展，含锌合金的大量生产与应用不可避免地造成了锌的污染，开发一种能实时监测环境或生物样本的锌含量的方法具有重大的现实意义[4-5]。目前已有的锌离子含量的检测手段包括了原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法等，但是仪器价格过于昂贵，样品制备和检测步骤繁琐制约了它们的应用；相比之下，锌离子荧光探针法以其价廉方便同时可实现精确定量的在线检测的优点，得到了学界的广泛关注[6]。

联萘酚衍生物具有两个富电子的萘环，以其量子产率高，可修饰位点多，可具有C1 或者C2 两种轴手性形式等优点成为荧光探针中的重要骨架结构。其中，C2 对称轴的联萘酚席夫碱衍生物以其手性轴对称的特殊空间构型，可引入的配位点多，与金属离子螯合性能强的特点，在金属离子荧光探针中占据着重要的地位[7-8]。本文即合成了一个C2 对称轴联萘酚亚胺类衍生物锌离子探针(S)-2，并初步探究了其对锌离子的识别的最优条件与机制。

1 仪器与试剂

LAMBDA750S 紫外/可视/近红外分光光度计(美国Perkin-Elmer 公司)，LS-55 型荧光光谱仪(美国Perkin-Elmer 公司)；Bruker 400 MHz 型核磁共振谱仪(瑞士Bruker 公司)，超高分辨质谱仪(美国Thermo-Fisher Scientif ic 公司)。

本文所用金属离子盐除锌源使用乙酸锌外，其余金属离子盐均为硝酸盐或氯化物，合成所需试剂，分析试剂均购自上海泰坦科技股份有限公司。

2 荧光探针(S)-2 的合成

称取3,3’- 二甲酰基-(S)- 联萘酚(0.75 mmol，257.2 mg) 和(1S,2R)-2- 氨 基-1,2- 二 苯 基 乙 醇 (1.57 mmol，336.5 mg) 置于50 mL 圆底烧瓶 中，加入干燥的二氯甲烷20 mL，装置用氮气保护，升温至42 ℃搅拌反应24 h。反应结束后，旋蒸移除溶剂，再用乙醇对残渣进行重结晶，抽滤得到亮黄色固体粉末(S)-2 480.9 mg，收率为89.10%。

探针经核磁与高分辨质谱表征的数据为：1HNMR(400 MHz，CDCl3) δ12.85(s, 2H),8.25(s, 2H), 7.83～7.77(m, 4H), 7.41～7.17(m, 12H), 5.29(s, 2H), 4.99(dd, J=7.4Hz, 2.2Hz, 1H), 4.45(d,J=7.4 Hz,2H).13CNMR(100 MHz,DMSO-d6) δ166.29, 154.74, 142.44, 140.81, 135.00, 133.98, 129.50, 128.64, 128.48, 128.42, 127.78, 127.66, 127.60, 127.55, 124.67, 123.69, 121.03, 116.44, 79.62, 77.27, 67.50. HRMS (ESI+) Calcd. For C50H41N2O4[M+H+]: 733.6088, Found: 733.6088。

3 样品溶液配制与测试方法

将(S)-2 溶于色谱纯四氢呋喃，各种常见金属离子盐用色谱甲醇溶解，均配置成浓度2×10-3M 的储备液用于后续实验，配制荧光测试样品时，先取计算量的(S)-2 储备液和金属离子储备液在5 mL 容量瓶中混合均匀，再用色谱甲醇定容。等摩尔连续变化法实验中，在样品中(S)-2 与Zn2+的总浓度保持为2×10-5M，在其余实验中，(S)-2 在样品中的浓度保持为2×10-5M，荧光测试的条件为激发光波长280 nm，入射狭缝/发射狭缝：5/5 nm。配制质谱测试样品时，将1 mL(S)-2 储备液与1.5 mL 的Zn(OAc)2储备液混合，用色谱甲醇稀释至5 mL。

4 实验结果与讨论

4.1 荧光探针(S)-2 可选择性识别Zn2+

在280 nm 激发光作用下，(S)-2 自身由于PET效应几乎不发出荧光，将等量的(S)-2 与各种金属离子作用后，如图1 所示，Zn2+与(S)-2 作用后能使得(S)-2 在514.5 nm 附近产生一个强烈的荧光发射峰(I/I0可高达400 倍以上)。在其余金属离子中，绝大部分对(S)-2 的荧光强度没有任何影响，仅Al3+和Cd2+能轻微增强(S)-2 的荧光，强度也不到Zn2+与(S)-2 作用的5%(510 a.u. vs 18.4 a.u.&16.2 a.u.), (S)-2 是一种具有高度选择性的Zn2+荧光探针。

图1 (S)-2 对Zn2+的选择性识别

4.2 荧光探针(S)-2 识别Zn2+的条件优化与抗干扰能力研究

鉴于(S)-2 对Zn2+有较好的识别效果，分别进行了主客体结合比和反应时间的探索，期望找到该荧光探针对Zn2+荧光响应的最佳条件，并在此条件研究下其他常见金属离子对(S)-2 识别Zn2+的干扰作用。

等摩尔连续变化法是研究主客体结合比的有效方法，(S)-2 与Zn2+作用的Job’s plot(图2(a))，Zn2+的摩尔比在0.6 时，荧光强度较高(即(S)-2 与Zn2+浓度比为2:3)，采用滴定法对这一推论做了进一步的验证，并研究在Zn2+浓度在最佳结合比之下时，(S)-2 与Zn2+作用后在λ=514.5 nm 处的荧光强度是否与Zn2+浓度有线性关系，结果如图2(b)和图2(c)所示，Zn2+当量在1.5 eq 以下时，λ=514.5 nm 处的荧光强度呈浓度依赖性上升，对滴定实验的多组平行数据做线性拟合计算，可得Zn2+浓度与荧光强度的回归方程为y=26.693x+11.184，R2达到0.994，线性度良好，利用公式LOD=3 s/k 可得出(S)-2 检测Zn2+的检测限为9.97 nm，Zn2+浓度达到1.5 eq 以后，荧光强度基本处于同一水平，故而我们可认为(S)-2 与Zn2+发生络合反应的结合比为2∶3，而且在9.97 nM～30 μM 的浓度范围内，(S)-2 可以实现对Zn2+的定量检测。基于此结果，继续研究(S)-2 与1.5 eq Zn2+作用的荧光强度与反应时间的关系的结果如图2(d)所示，在设置的反应时间内(10～180 min), 样品的荧光强度始终保持同一水平，这说明(S)-2 与Zn2+的反应十分迅速，在10 min 内即达到平衡并且能长时间维持稳定。(S)-2对Zn2+有实现在线检测的潜力。

图2 (S)-2 对Zn2+的识别条件优化

在前述实验中探索出的对Zn2+的最佳识别条件下，我们采用竞争性实验研究其他常见离子对(S)-2识别Zn2+的干扰，结果如图3 所示。加入Al3+会导致(S)-2 与Zn2+作用产生的荧光完全猝灭，Fe3+、Pb2+、Cd2+也会明显影响(S)-2 与Zn2+的作用，而其他离子对(S)-2 识别Zn2+几乎没有干扰，考虑到竞争实验中干扰离子与Zn2+是等量的，但是干扰离子在环境或生物样本中相对于Zn2+含量较低，(S)-2 仍具有实际应用的潜力。

4.3 探针识别Al3+的机制研究

图3 常见金属离子对(S)-2 识别Zn2+的干扰作用

(S)-2 与Zn2+结合比的最直观证据是(S)-2 与Zn2+生成的配合物的晶体结构，在无法获得晶体的情况下，高分辨质谱可从侧面证明配合物的存在，(S)-2 与Zn2+反应后的质谱谱图可见一组827.673 3、827.172 7 附近，峰间距为0.5 左右的多重质谱峰，与[2(S)-2+3Zn]2+的质荷比计算值827.676 5、827.174 8高度吻合。结合文献报道[9-10]，对[2(S)-2+3Zn]2+的可能结构进行了建模(如图4 所示)并推测识别机制：三个Zn2+可以与两个(S)-2 分子形成3+2 鳌合离子，其中一个Zn2+同时与两个(S)-2 上的相邻的酚羟基与亚胺基团鳌合，另外两个Zn2+则分别与同一个(S)-2上剩余的鳌合位点结合，所有Zn2+均是四配位结构。对于(S)-2 来说，同侧的酚羟基与亚胺氮原子有可能形成分子内氢键伴随质子转移而产生a-PET 效应，导致(S)-2 自身并没有荧光，当Zn2+与(S)-2 发生鳌合反应后，原有的分子内氢键被破坏，质子转移效应消失，(S)-2 占据HOMO 轨道的电子进入[Zn3((S)-2)2]2+的配位键，而LUMO 轨道的电子在激发态下可顺利进入HOMO 轨道，使得a-PET 效应受阻，形成CHEF(鳌合致荧光增强)效应。

图4 (S)-2 与Zn2+可能的结合模式

5 结语

本文设计并合成对Zn2+具有良好识别效果的联萘酚亚胺类荧光探针(S)-2，(S)-2 在λ=280 nm 的激发条件下自身不发出荧光，但是与Zn2+发生配位反应后由于CHEF 效应可在λ=514.5 nm 附近出现强荧光发射峰；通过等摩尔连续变化法确定了(S)-2 与Zn2+作用的结合比为2:1，滴定实验进一步确认结合比，还证明了在Zn2+的浓度范围为9.97 nM～30 μM之间时，与(S)-2 作用的Zn2+浓度与两者作用后在λ=514.5 nm 处的荧光强度呈显著的线性关系，回归方 程为y=26.693x+11.184，(S)-2 与Zn2+结合 迅 速，10 min 内即可达到平衡，在3 h 内保持稳定，在最佳的识别条件下，Al3+对(S)-2 的识别作用有明显干扰。高分辨质谱证明了[Zn3((S)-2)2]2+的存在，也佐证了(S)-2 识别Zn2+的机制。(S)-2 有望发展成可用于实际Zn2+检测工作的荧光探针。