丙泊酚对前列腺癌PC3细胞恶性生物学行为及Nrf2/ARE通路的影响

张文杰， 王祥， 徐晓丽， 郑荇月

(海安市人民医院麻醉科，江苏省海安市226600)

前列腺癌为前列腺上皮恶性细胞肿瘤，前列腺癌变是一个多步骤的过程，包括启动、促进和进展，基因改变的积累导致启动细胞转化为癌前细胞群，最终形成具有侵袭和转移能力的肿瘤[1]。癌症患者术后需服用抗癌药物和放射治疗以防止复发和转移，而抗癌药物通常贵且不良反应多，因此迫切需要新的经济高效的抗癌药物。丙泊酚是一种临床上常用的静脉麻醉药物，有研究表明，丙泊酚可有效抑制子宫内膜癌、胰腺癌、卵巢癌和肺癌细胞增殖、生长和迁移[2-3]。越来越多研究发现，诱导参与致癌物解毒的抗氧化酶和抗氧化剂与肿瘤的发生发展密切相关，而核因子E2相关因子2(nuclear factor erythtoid 2 related factor 2，Nrf2)通过激活位于编码这些酶的启动子区基因的抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)参与氧化应激的调控[4]。因此，本研究分析丙泊酚对前列腺癌细胞(prostate cancer cell 3，PC3)增殖、侵袭和凋亡及Nrf2/ARE通路的影响，为前列腺癌的临床治疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 试药和仪器

丙泊酚购自中国食品药品检定研究院；细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8)购自上海优宁维生物有限公司；FITC凋亡试剂盒购自美国Sun-Shine公司；Nrf2、ARE蛋白抗体购自美国Abcam公司；二抗(山羊抗兔)购于武汉三鹰生物有限公司。5320R4℃离心机购于德国徕卡公司；伯乐Mini-PRO TEAN电泳仪购于美国伯乐公司；LAS 4000成像系统购于美国GE Healthcare公司；BD FACSCanto II 流式细胞仪购于美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 细胞培养和分组

前列腺癌PC3细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司。复苏后的细胞置于1640培养基5%CO2、37 ℃培养箱中进行培养，24 h更换培养基，当细胞覆盖70%时，加入胰蛋白酶，进行细胞传代。按照处理因素将细胞分为空白对照组(0 mg/L)、丙泊酚低剂量组(2 mg/L)、丙泊酚中剂量组(4 mg/L)、丙泊酚高剂量组(6 mg/L)和阳性对照组(75 nmol/L阿霉素)。

1.3 CCK-8法检测细胞存活率

取对数生长期细胞，加入1 mL胰蛋白酶吹打2 min，2 000 r/min离心10 min,倒掉上清液，加入1 mL 1640培养基，轻微吹打细胞使细胞充分悬浮，将细胞悬液转移到96孔板中培养24 h弃培养基，每孔加入新1640培养基和各组不同处理因素，每组6个复孔，培养24 h，去除培养液。每孔加入100 μL培养液和10 μL CCK-8溶液，持续培养3 h，使用Bio-Rad微孔板阅读器读取450 nm处光密度，重复3次，计算细胞存活率。

1.4 改良Matrigel Boyden室法测定细胞侵袭性

将各组细胞接种到有基质胶的滤膜上，下室放入10%FBS作为趋化剂。放入培养箱培养24 h，取出滤膜，并进行染色，倒置显微镜下每个滤膜随机选择5个视野计数细胞，重复3次取平均值。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡率

使用FITC凋亡试剂盒流式细胞术检测细胞凋亡率。将细胞洗涤2次，用1×结合缓冲液1×106个/mL细胞悬浮于400 μL FITC溶液中，黑暗中室温孵育15 min，然后加入染色液(10 μL)，4 ℃避光孵育5 min，立即用流式细胞仪分析细胞，重复3次。

1.6 Western blotting检测细胞相关蛋白表达

各组细胞弃去培养液，加入1 mL 磷酸盐缓冲液和100 μL蛋白酶K溶液，使细胞悬浮，超声细胞破碎仪作用2 min破碎细胞，3 000 r/min 4 ℃离心20 min，取上清。经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜和封闭后用特异性抗体Nrf2、ARE和肌动蛋白(β-actin)4 ℃孵育12 h，孵育后的条带清洗3次(1%吐温)，二抗孵育2 h，观察结果。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 丙泊酚对细胞存活率、侵袭力和凋亡率的影响

与空白对照组比较，丙泊酚组和阳性对照组PC3细胞存活率、侵袭力均显著降低，细胞凋亡率显著升高，且效应呈丙泊酚剂量依赖性(P<0.05)。与阳性对照组比较，丙泊酚低剂量组和中剂量组PC3细胞存活率、侵袭力显著升高，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，而丙泊酚高剂量组差异无显著性(P>0.05；表1)。

2.2 丙泊酚对细胞Nrf2、ARE蛋白表达的影响

与空白对照组比较，阳性对照组和丙泊酚组Nrf2、ARE蛋白表达水平显著降低，且呈丙泊酚剂量依赖性(P<0.05)；丙泊酚高剂量组与阳性对照组阿霉素作用效果相似(P>0.05；图1和表2)。

表2 丙泊酚对PC3细胞Nrf2、ARE蛋白表达的影响

图1 不同剂量丙泊酚作用后前列腺癌PC3细胞蛋白印迹图1为空白对照组；2为丙泊酚低剂量组；3为丙泊酚中剂量组；4为丙泊酚高剂量组；5为阳性对照组。

3 讨 论

前列腺癌是最常见的恶性肿瘤，也是发达国家男性癌症死亡的第二大原因[5]。前列腺癌病程进展缓慢，早期无明显的临床症状，因此患者容易错过早期的最佳治疗时间，当肿瘤细胞发生迅速增殖和扩散，导致患者出现排尿异常等一系列临床症状时，往往已经到了疾病晚期，使得病情加重[6]。据统计，2018年前列腺癌全年全球近130万新增病例，占男性恶性肿瘤发病率的13.5%，位居第二[7]。因此了解和评价其具体作用机制，寻找有效的、新的检测方法来提高前列腺癌早期发现率、预后预测及个性化治疗是一个迫切的问题。丙泊酚是一种全身镇静催眠药，广泛应用于全身麻醉的诱导和维持。越来越多的证据表明丙泊酚有几种非麻醉作用，近年来研究发现，丙泊酚具有抑制癌细胞增殖、黏附、转移和诱导癌细胞凋亡等潜在的抗癌作用[8]。有研究报道，丙泊酚可通过降低经脂多糖处理的非小细胞肺癌细胞中HIF-1的表达来抑制细胞侵袭和逆转。此外，丙泊酚可抑制肺癌、胰腺癌和宫颈癌细胞的生存能力并诱导其凋亡[9]。本研究检测了不同剂量梯度的丙泊酚对前列腺癌PC3细胞的影响，发现丙泊酚可明显影响前列腺癌PC3细胞增殖和侵袭能力，并且随着丙泊酚干预剂量的增加，其对前列腺癌PC3细胞增殖和侵袭的抑制效果越明显，表明丙泊酚可有效缓解前列腺癌PC3细胞的增殖速度，同时通过抑制其侵袭能力以达到阻止肿瘤细胞扩散的可能。同时本研究通过流式细胞仪检测了丙泊酚对前列腺癌PC3细胞凋亡的影响，结果发现，丙泊酚可增加细胞凋亡率，并呈剂量效应关系，进一步说明了丙泊酚对前列腺癌的抑制作用，通过增加其细胞凋亡率以达到缓解疾病进程的目的。

在临床实践中，常静脉给予丙泊酚，因其起效短、恢复快而被广泛应用于各种手术中,近年来，其抗肿瘤作用已成为研究热点[10]。多项研究表明，丙泊酚具有抗氧化作用，主要作用于线粒体复合物I，降低细胞内活性氧水平。Nrf2/ARE信号通路与机体氧化应激密切相关，Nrf2是机体中维持细胞氧化还原平衡的关键翻译因子[11]。Nrf2/ARE信号通路的异常高表达在多种癌症的转移过程中起着关键作用[12]。Nrf2表达的增加，可诱导其下游基因磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶-1和血红素氧化酶-1的表达，造成机体氧化应激进一步加重，从而反向调控受体ARE的表达，机体的异常氧化应激反应，可导致肿瘤细胞增殖和迁移活性增加，从而导致疾病加重[13]。因此，本文检测了Nrf2和其下游ARE蛋白的表达，发现在未对前列腺癌PC3细胞进行任何处理时，Nrf2和ARE蛋白均呈现高表达状态，当给予丙泊酚干预后，Nrf2和ARE表达均下调，且具有明显剂量依赖性，表明丙泊酚可能通过调节Nrf2/ARE信号通路来降低细胞内氧化应激反应，减少细胞氧化应激因子的表达，从而抑制前列腺癌PC3细胞增殖和侵袭，并促进其凋亡。

综上所述，本研究结果表明丙泊酚可有效抑制前列腺癌PC3细胞增殖与侵袭，并促进其凋亡，其作用效果与丙泊酚的剂量密切相关。此外，本研究结果表明丙泊酚的抑制增殖与侵袭以及促凋亡的作用，可能与通过调控细胞Nrf2/ARE信号通路来抑制其氧化应激有关，其具体作用机制后续将深入探究，以期为临床上前列腺癌的治疗提供新的方向和实验依据。