重离子辐照诱变增强枯草芽孢杆菌纤维素降解能力

张丽敏 李永丽 胡建华 崔金娜 刘占英 朱明达

1（内蒙古工业大学化工学院 呼和浩特 010051）

2（内蒙古自治区发酵产业节能减排工程技术研究中心 呼和浩特 010051）

3（生物发酵绿色制造内蒙古自治区工程研究中心 呼和浩特 010051）

植物纤维素是自然界中最丰富的可再生资源。借助纤维素酶的水解作用，将纤维素转化为可直接利用的资源与能源，可以缓解能源危机以及能源对环境污染的问题，同时也可以实现对农业剩余资源的高效利用。纤维素酶是一类将纤维素水解成葡萄糖的酶的统称，又可将纤维降解为可被畜禽机体消化吸收的还原糖，从而提高饲料利用率，纤维素酶的产生菌包括细菌、真菌和放线菌等。但细菌产纤维素酶的量较少，产酶活力也不高，导致应用成本偏高，限制了细菌纤维素酶在饲料工业中产业化的应用。因此，选育高纤维素酶活性的菌株具有重要的现实意义。重离子束作为一种高效的人工电离辐射，已经越来越多地出现在研究者们的视线中，重离子辐照诱变可获得更高的突变率和更广的突变类型，目前已被广泛用于微生物的诱变选育中［1-2］。姜伯玲［3］选育得到1 株经重离子辐照诱变后的高产纤维素酶突变菌株，最终使纤维素酶的滤纸酶活最大提高了68.87%。韩鹏军等［4］应用不同剂量12C+6重离子束对金霉素链霉菌进行辐照诱变，金霉素链霉菌的诱变效果显著，发酵效价较未诱变菌株提高14.4%。麻和平［5］采用重离子束12C6+对产细菌素植物乳杆菌进行辐照选育，正突变菌株Lp092、Lp085 抑菌圈直径比出发菌株分别扩大了20.64%、19.36%，且均具有良好的产细菌素遗传稳定性。Yadav 等［6］采用低强度离子对枯草芽孢杆菌ABDR0 进行辐照，筛选到一株高活力纤维素酶生产菌株。

这些诱变育种取得了一定的研究成果，加速了重离子束辐照诱变育种的研究与应用，也获得了较大的经济效益与社会效益［7］。本研究以产纤维素酶的枯草芽孢杆菌为出发菌株，通过对其进行80 MeV/u 的12C6+离子束辐照诱变，以期筛选出高纤维素降解突变株，并且获得一种改良枯草芽孢杆菌的有效途径，为生产饲料添加剂提供一种优质的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp.subtilis24799）、枯草芽孢杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp.subtilis24739）、枯草芽孢杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp.subtilis24603）：购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis1.7417）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis1.6757）：购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。

1.1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）：牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、琼脂20.0。筛选培养基（g/L）：羧甲基纤维素钠10.0、蛋白胨10.0、酵母提取粉5.0、NaCl 10.0、磷酸二氢钾1.0、硫酸镁0.5、琼脂20.0。发酵培养基（g/L）：玉米麸皮2.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、磷酸二氢钾1.0、硫酸镁0.5。上述培养基均用去离子水定容，并调节pH=7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 纤维素降解率与内切葡聚糖苷酶活力测定

纤维素降解率测定参照文献［8-9］。

绘制葡萄糖标准曲线后，采用二硝基水杨酸（DNS）法［10］测定内切葡聚糖苷酶活力。

酶活力（U）定义：在50 ℃，pH=7.0 的条件下，每1 mL 粗酶液每分钟分解羧甲基纤维素钠产生1 μmol 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

1.2.2 重离子辐照诱变选育高纤维素降解率枯草芽孢杆菌

采用中国科学院近代物理研究所的兰州重离子研究装置（HIRFL）进行辐照诱变。12C6+离子束能量80 MeV/u，吸收剂量分别为0 Gy、40 Gy、80 Gy、120 Gy、160 Gy和200 Gy。

诱变后菌株致死率计算见式（1）。将未辐照与辐照后菌液进行梯度稀释后，均匀涂布在牛肉膏蛋白胨固体培养基上，30 ℃恒温培养48 h。然后统计菌落数进行致死率的计算。

采用刚果红染色法［11］筛选具有产纤维素酶能力的菌株。将上述活化好的菌株进行梯度稀释，并取40 μL 于羧甲基纤维素钠固体培养基上涂布，置于30 ℃恒温培养箱中培养。待菌落长出后在培养皿上滴加0.5%刚果红溶液染色15 min，5%NaCl 溶液脱色15 min，产生纤维素酶的菌落周围会出现透明圈。记录透明圈（H）与菌落（C）直径，并按公式（2）进行正突变率计算。

高纤维素降解率菌株的复筛。测定纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力。

降解率稳定性测定。将复筛得到的突变菌株Bacillus subtilisCG-40-1 在相同条件下连续传代培养12次［12］，每隔两代测定其纤维素降解率及纤维素酶活力，观察其稳定性。

1.2.3 高产菌株发酵条件优化

对发酵时间、温度和pH 发酵条件进行优化，提高菌株对纤维素降解的能力。设置3个发酵平行组，以5%的接种量接种至发酵培养基中，30 ℃、180 r/min 培养216 h，分别测定培养24 h、72 h、120 h、168 h 和216 h 时纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力。根据测定结果选择最优培养时间，并在此培养条件下探索不同温度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃）对纤维素降解率及酶活力的影响。根据测定结果选择最适发酵温度，在最适温度的基础上，设置不同的初始pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5），测定初始pH对纤维素降解率及酶活力的影响。最终确定发酵产酶的最佳条件。

2 结果与分析

2.1 高纤维素降解能力出发菌株的筛选

枯草芽孢杆菌的生长曲线测定结果见图1。由图1可知，5株枯草芽孢杆菌的生长趋势基本一致。在5～15 h 内，细胞数量以对数增长，而Bacillus subtilisCGMCC1.7417 的生长情况明显优于其他4株菌，后期可重点关注该菌株的纤维降解能力及纤维素酶活力。综合考虑细胞生物量等因素，选择培养12 h的菌体细胞进行后续实验。

图1 菌株生长曲线Fig.1 Growth curves of strains

菌株的生长速度只是菌株筛选的一项指标，本研究的主要目的在于筛选高纤维素降解率的枯草芽孢杆菌进而应用到后续研究中，所以在上步研究的基础上分别测定了几株菌的纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力、外切葡聚糖苷酶活力、β-葡萄糖苷酶活力。经测定以上5株菌不具备外切葡聚糖苷酶及β-葡萄糖苷酶活力。枯草芽孢杆菌纤维素降解率及酶活力测定结果见图2。由图2可知，5 株枯草芽孢杆菌的纤维素降解率均在30%～50%，而Bacillus subtilisCGMCC1.7417 的纤维素降解率较其他菌株高，同时内切葡聚糖苷酶活力也为最高值。Bacillus subtilisCGMCC1.7417 的纤维素降解率和内切葡聚糖苷酶活力分别为（45.06±2.51）%和（1.77±0.03）U/mL。结合菌株细胞生物量及纤维素降解率、内切葡聚糖苷酶活力的测定结果，选定Bacillus subtilisCGMCC1.7417 作为后续实验菌株。

图2 高纤维素降解率和酶活力菌株筛选结果；肩注小写字母不同表示差异显著（p＜0.05），大写字母不同表示差异极显著（p＜0.01）Fig.2 Screening results of strains with high cellulose degradation rate and enzyme activity；different lowercase letters on shoulders indicate significant differences(p＜0.05),and different capital letters indicate extremely significant differences(p＜0.01)

2.2 诱变后菌株致死率和正突变率计算结果

选取稀释梯度为10-5时的数据计算致死率，由图3可知，该致死率曲线随着吸收剂量的增大出现先增后降再增的趋势。在吸收剂量为120 Gy 时，菌株致死率最高，为68.37%。重离子束辐照诱变过程中，细胞存活率随吸收剂量的增加先上升后下降再上升，细胞存活曲线近似呈现“马鞍形”变化趋势，即说明细胞在高吸收剂量下仍可保持较高的突变率及存活率，突变谱大大增加［13］，致死率呈现“马鞍形”剂量-效应曲线［14］。

根据透明圈直径与菌落直径之比计算诱变的正突变率，结果见图3。

图3 致死率、正突变率曲线Fig.3 Curves of mortality and positive mutation rate

如图3所示，随着吸收剂量的增大，菌株的正突变率呈现先增大后减小的趋势。综合分析，吸收剂量为120 Gy 时，正突变率最高，为84.23%，且此时H/C值最大。由此说明，随着吸收剂量的增大，致死率也随之增高，此时DNA 的损伤程度越严重，菌株的突变率越高，越易发生正突变［15］。

2.3 高纤维素降解能力菌株的初筛与复筛

2.3.1 初筛结果

Bacillus subtilisCGMCC1.7417 经重离子辐照诱变后，观察菌落透明圈，同时测量H与C，计算H/C值，枯草芽孢杆菌诱变前后透明圈变化如图4所示，初筛结果见表1。

由图4和表1可知，枯草芽孢杆菌经重离子辐照诱变后，大多数菌落的透明圈变大，即H/C值增大，说明其纤维素酶活力提高，为正突变；反之则为负突变。本实验从约1 620个单菌落中，通过比较H/C值，初筛得到9株菌株，并按菌株吸收剂量进行命名，分别命名为CG-40-1、CG-80-1、CG-120-1、CG-120-2、CG-120-3、CG-200-1、CG-200-2、CG-200-3 和CG-200-4，原始菌株命名为CG-0。

图4 诱变前后菌落透明圈：（a）出发菌株；（b）诱变后正突变菌株Fig.4 Colony transparent circles before and after mutagenesis：(a)starting strain；(b)mutagenic strains

表1 初筛结果Table 1 The results of primary screening

2.3.2 复筛结果

Bacillus subtilisCGMCC1.7417 经重离子辐照诱变后，初筛得到9株菌株，对初筛菌株进行纤维素降解率及酶活力的测定进行复筛，复筛结果见图5。

由图5 可知，与原始菌株相比，9 株菌纤维素降解率均有提高，其中诱变菌株CG-40-1的纤维素降解率最高，为(53.07±0.75)%，与Bacillus subtilisCG-0相比，纤维素降解率提高了22.06%，酶活力也相应提高了23.07%，说明经重离子辐照诱变后枯草芽孢杆菌的纤维素降解率显著提高。分析原因可能是经过重离子诱变后，与产纤维素酶相关的基因发生改变导致其产量增加。与初筛结果相比，H/C值与纤维素降解率有一定的正相关性，说明初筛结果可靠。

图5 高纤维素降解率和酶活力菌株复筛结果；肩注小写字母不同表示差异显著（p＜0.05），大写字母不同表示差异极显著（p＜0.01）Fig.5 Strains with high cellulose degradation rate and enzyme activity Rescreening results；different lowercase letters on shoulders indicate significant differences(p＜0.05),and different capital letters indicate extremely significant differences(p＜0.01)

重离子辐照作为一种微生物诱变的有效手段，在工业微生物的诱变选育将具有广阔的应用空间。本课题组刘艳新等［16］利用不同剂量12C6+重离子束对枯草芽孢杆菌B.subtilis20076进行辐照诱变，诱变后通过透明圈初筛和酶活力验证复筛方式选育出一株复合酶活力较高的菌株B.subtilisKC-1。与原始菌株相比，其发酵液滤纸酶活力、内切葡聚糖酶活力、β-葡萄糖苷酶活力、外切葡聚糖酶活力、蛋白酶活力和α-淀粉酶活力分别提高了20.2%、79.6%、98.2%、7.4%、10.4% 和27.4%，且遗传稳定性实验结果表明，该突变株具有良好的稳定性。薛林贵等［17］对芽孢杆菌属菌株G-41进行两次重离子辐照诱变处理，一次诱变筛选得到碱性蛋白酶高产突变株G-41-68，二次诱变获得突变株15 Gy-54。两株突变菌株的酶活力与原始菌株相比分别提高了1.58 倍和2.65 倍。重离子束辐照作为一种高效的诱变手段，现已广泛应用于我国工业微生物育种实践中［18］，通过重离子辐照技术，可以有效得到生产性能较高的目的工业菌株。本实验利用重离子辐照诱变枯草芽孢杆菌，诱变后菌株纤维素降解能力明显提高，由此可见，重离子辐照可作为一种微生物诱变的有效手段，在工业微生物的诱变选育具有广阔的应用空间。

2.4 高纤维素降解能力菌株稳定性测定

对诱变菌株Bacillus subtilisCG-40-1 降解纤维素能力的稳定性进行分析，连续传代培养12 代，每隔2 代测其纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力，测定结果见图6。

图6 CG-40-1纤维素降解率和酶活力稳定性结果；肩注小写字母不同表示差异显著（p＜0.05），大写字母不同表示差异极显著（p＜0.01）Fig.6 The cellulose degradation rate and enzyme activity stability results of CG-40-1；different lowercase letters on shoulders indicate significant differences(p＜0.05),and different capital letters indicate extremely significant differences(p＜0.01)

由图6 可知，Bacillus subtilisCG-40-1 的纤维素降解率约为52%，各代之间差异不显著，说明CG-40-1的具有良好的遗传稳定性。综上所述，本实验通过重离子诱变得到高纤维降解率菌株Bacillus subtilisCG-40-1，其纤维降解率显著提高，与Bacillus subtilisCG-0 相比提高了22.03%。经比较分析可知，重离子诱变枯草芽孢杆菌效果明显，且与γ 射线、中子等辐照诱变相比，遗传稳定性更好［19］。

2.5 高纤维素降解能力菌株发酵条件优化结果与分析

考察突变菌株Bacillus subtilisCG-40-1 在不同发酵时间、温度、pH条件下对纤维素的降解能力。

2.5.1 发酵时间对CG-40-1纤维素降解率的影响

突变菌株Bacillus subtilisCG-40-1 在不同发酵时间对纤维素降解能力的影响见图7。由图7可知，在0～216 h 突变菌株Bacillus subtilisCG-40-1 随着发酵时间的延长，纤维素降解率、内切葡聚糖苷酶活力不断增大，120 h 之后纤维素降解率、内切葡聚糖苷酶活力逐渐降低。原因可能是发酵后期培养基中营养物质不足，pH 发生变化及溶氧不足导致菌株性能下降，纤维素降解率、内切葡聚糖苷酶活力降低。说明发酵120 h 时纤维素降解率、内切葡聚糖苷酶活力达到最大，此时纤维素降解率和内切葡聚糖苷酶活力为(57.91±1.96)%和(2.33±0.02)U/mL，且差异显著。因此，确定最佳发酵时间为120 h。

图7 发酵时间对纤维素降解能力的影响；肩注小写字母不同表示差异显著（p＜0.05），大写字母不同表示差异极显著（p＜0.01）Fig.7 Effects of fermentation time on fiber degradability；different lowercase letters on shoulders indicate significant differences(p＜0.05),and different capital letters indicate extremely significant differences(p＜0.01)

2.5.2 发酵温度对CG-40-1纤维素降解率的影响

原始菌株Bacillus subtilisCG-0 在不同发酵温度对纤维素降解能力的影响见图8。原始菌株Bacillus subtilisCG-0 在发酵温度为35 ℃时，纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力最大，分别为(48.24±1.09)% 和(1.82±0.02) U/mL， 突变菌株Bacillus subtilisCG-40-1 在不同发酵温度对纤维素降解能力的影响如图9 所示。当温度逐渐升高时，突变菌株Bacillus subtilisCG-40-1 纤维素降解率、内切葡聚糖苷酶活力先增大后减小。当温度为45 ℃时，纤维素降解率和内切葡聚糖苷酶活力均达到峰值， 分别为(65.13±0.48)% 和(2.41±0.03)U/mL。由此可以说明，温度过高或过低都会影响菌株纤维素酶活力，可能原因是温度影响了菌株的生长繁殖，进而影响了产纤维素酶能力。枯草芽孢杆菌经重离子辐照诱变后，最适发酵温度由35 ℃提高为45 ℃。研究表明，发酵温度不仅会影响发酵速度，还会影响发酵产物的积累及活性［20］。在工业生产中，较高的发酵温度有利于加快发酵速度，提高发酵效率，减少冷却水的使用量，降低能耗和生产成本［21］。因此，确定突变菌株Bacillus subtilisCG-40-1 的最佳发酵温度为45 ℃。

图8 发酵温度对出发菌株纤维素降解能力的影响；肩注小写字母不同表示差异显著（p＜0.05），大写字母不同表示差异极显著（p＜0.01）Fig.8 Effects of fermentation temperature on fiber degradability；different lowercase letters on shoulders indicate significant differences(p＜0.05),and different capital letters indicate extremely significant differences(p＜0.01)

图9 发酵温度对CG-40-1纤维素降解能力的影响；肩注小写字母不同表示差异显著（p＜0.05），大写字母不同表示差异极显著（p＜0.01）Fig.9 Effects of fermentation temperature on fiber degradability；different lowercase letters on shoulders indicate significant differences(p＜0.05),and different capital letters indicate extremely significant differences(p＜0.01)

2.5.3 初始pH对CG-40-1纤维素降解率的影响

研究表明，pH对发酵过程的影响极大，pH会对发酵中代谢途径产生影响，同时也会影响发酵产物的活性［22］。适当的pH会促进发酵，因此发酵过程中选择合适的pH 极为重要。突变菌株Bacillus subtilisCG-40-1在不同初始pH对纤维素降解能力的影响如图10 所示。突变菌株Bacillus subtilisCG-40-1 在pH 为5.5～7.5 内均有酶活力，随着初始pH的增大，纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力呈现先增大后减小的趋势。当初始pH为6.5时，纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力达到最大，分别为(67.79±0.49)%和(2.56±0.02) U/mL，且差异极显著。而在pH≥6.5 时，纤维素降解率及内切葡聚糖苷酶活力均有所下降，说明CG-40-1适在中性偏酸环境下生长。据文献报道，中性偏酸环境下产纤维素酶菌株的酶活力更高［23-24］。通过分析，确定Bacillus subtilisCG-40-1 的最佳初始pH为6.5。

图10 初始pH对纤维素降解能力的影响；肩注小写字母不同表示差异显著（p＜0.05），大写字母不同表示差异极显著（p＜0.01）Fig.10 Effects of initial pH on fiber degradability；different lowercase letters on shoulders indicate significant differences(p＜0.05),and different capital letters indicate extremely significant differences(p＜0.01)

3 结论

本研究选择一株具有较高纤维素酶活力的枯草芽孢杆菌为出发菌株，进行重离子辐照诱变。通过80 MeV/u 的12C6+离子束辐照后，从羧甲基纤维素钠筛选培养基平板上分离出9株H/C值高的正突变菌株，其中突变菌株Bacillus subtilisCG-40-1的H/C值及纤维降解率提高的幅度最大，为17.75%，酶活力经过诱变后提高了23.08%。经过12代传代培养，菌株具有良好的纤维降解稳定性。对其进行单因素优化试验后，最终得到突变菌株Bacillus subtilisCG-40-1 的最适发酵时间、温度、初始pH 分别为120 h、45 ℃、6.5，在此发酵条件下纤维素降解率为(67.79±0.49)%，较未优化时提高27.74%。与同类产纤维素酶的芽孢杆菌相比，突变菌株Bacillus subtilisCG-40-1 对纤维素有良好的降解能力，纤维素酶活力高，具有相当广阔的应用前景。

近年来，众多研究学者通过重离子辐照后获得一些优良的微生物突变体，并在生物工业中发挥了重要作用。因此，对重离子辐照生物体的诱变机理进行解析，将进一步提高该项技术的应用价值。但是目前对重离子诱变机制的研究相对较少。幸运的是，随着新的生物学技术为重离子诱变微生物机理研究提供了新的途径。通过未来结合不同的组学工具来阐明重离子诱变的作用机制，将在高效利用微生物资源、改善生态环境等方面发挥巨大的作用。

作者贡献说明刘占英和张丽敏提出了本文的研究思路和实验方案；张丽敏完成本文所有涉及的实验及分析；李永丽和胡建华帮助解决实验中遇到的难点；崔金娜和朱明达指导本文的撰写及修改。所有作者均已阅读并认可该论文最终版的所有内容。