应用网络药理学预测白芍抗血吸虫病及肝纤维化的作用机制

杨 玺，李 彬，刘如爱，王播勇，杨 娜，马运敏，肖朝江，姜 北，熊 伟，，*

（1.大理大学 基础医学院，云南 大理 671000；2.云南省高校临床生物化学检验重点实验室，云南 大理 671000；3.云南省滇西抗病原植物资源筛选研究重点实验室，云南 大理 671000）

全世界约有2.4亿人感染血吸虫病，肝血吸虫病的主要病理改变是肝肉芽肿和虫卵纤维化进而导致肝纤维化［1］。肝纤维化是由于多种慢性肝损伤引起的异常创面修复反应，其特征为弥漫性细胞外基质过度沉积和结缔组织异常增生，可进一步发展为肝硬化、肝功能衰竭或肝癌［2］。肝纤维化引起的门脉高压和腹水通常是慢性肝血吸虫病患者死亡的主要原因［3］，肝纤维化是一个可逆转的过程，只要肝脏不是处于晚期肝硬化阶段，经过积极的治疗，清除引起纤维化反应的物质有助于纤维化的消退［4］。白芍（Paeonia lactifloraPall，PRA）是毛茛科芍药属植物的根，广泛用于治疗肝病［5］。芍药苷（Paeoniflorin，PF）是PRA的主要活性成分，可以抑制诱导型一氧化氮合酶的活性和蛋白质表达水平，减少IL-8的产生，从而发挥保心保肝作用［6］。但白芍治疗肝纤维化的具体作用机制尚不清楚。近年来网络药理学越来越多地应用于研究生物活性化合物与疾病靶点之间的相互作用［7］。本研究将运用网络药理学的方法预测白芍抗血吸虫病及肝纤维化的主要化学成分、靶点及作用机制，为白芍的临床应用以及血吸虫病和肝纤维化的基础与临床研究提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 白芍中有效成分的筛选使用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“白芍”为关键词，以口服生物利用度（OB）≥30%和药物相似性（DL）≥0.18作为候选化合物的筛选标准，筛选白芍的关键活性成分。同时点击“Related Targets”选项，获取其活性成分的有效靶点。通过Perl脚本利用UniProt数据库（http：//www.uniprot.org/）对筛选出的有效靶点进行基因名注释。

1.2 获取白芍、血吸虫病及肝纤维化的共同靶点基因以“schistosomiasis”和“liver fibrosis”为关 键 词 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库中检索血吸虫病和肝纤维化对应的靶点基因，分别与白芍预测靶点基因进行匹配，通过在线工具Draw Venn Diagram（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）得到共同靶点韦恩图。

1.3 药物—成分—靶点—疾病网络的构建将白芍、白芍有效成分、白芍靶点基因、白芍和血吸虫病及肝纤维化共同靶点基因用Perl软件进行映射，通过Cytoscape3.8.2软件（http：//www.cytoscape.org/）构建白芍抗血吸虫病及肝纤维化的药物—成分—靶点—疾病网络图。

1.4 白芍抗血吸虫病及肝纤维化PPI网络的构建及关键靶点的筛选将白芍抗血吸虫病及肝纤维化的靶点基因导入STRING数据库（https：//string-db.org/），物种设置为“Homo sapiens”，设置combined score＞0.4并隐藏游离点，利用R语言处理所得tsv文件，得到蛋白质互作网络核心靶点基因的条形图。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析通过在R语言中安装org.Hs.eg.db包、clusterProfiler包、ggplot 2包、dplyr包和DOSE包，导入白芍抗血吸虫病及肝纤维化相关靶点，进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析和可视化展示，得到白芍抗血吸虫病及肝纤维化的生物学过程（Biological process），分子功能（Molecular founction）和细胞组成（Cellular component）以及潜在信号通路信息。

2 结果

2.1 白芍中有效成分的筛选结果通过TCMSP数据库检索白芍的有效成分，基于OB≥30%且DL≥0.18的条件筛选出白芍主要有效成分13种（表1），提示这13种成分是白芍的重要活性成分。

表1 白芍活性成分筛选结果Table 1 Screening of active components of Paeonia lactiflora Pall

2.2 白芍抗血吸虫病及肝纤维化作用靶点的预测结果使用GeneCards数据库查找血吸虫病及肝纤维化相应的基因靶点，与白芍有效成分基因靶点进行匹配，通过在线工具Draw Venn Diagram得到16个活性成分-疾病共同靶点，分别是PTGS2、BCL2、BAX、JUN、NOS2、ACHE、MMP1、CYP3A4、CYP1A2、ICAM1、SELE、VCAM1、GSTP1、INSR、GSTM1、CAT（图1）。

图1 白芍与血吸虫病及肝纤维化靶点交集的韦恩图Fig.1 Venn diagram of target intersection of Paeonia lactiflora Pall with schistosomiasis and liver fibrosis

2.3 药物—成分—靶点—疾病网络构建结果为了进一步了解化合物与相应靶标之间的相互作用关系，将得到的有效活性成分和交集靶点导入Cytoscape 3.8.2中进行网络构建，得到“药物—成分—靶点—疾病”关系网络图。网络包含21个结点和40条边（图2）。其中，菱形图标为疾病，圆形图标为交集靶点，三角形图标为药物，V形图标为活性成分。通过将3种化合物匹配到16个潜在靶点，可以看出与关键靶点连接的成分主要有山奈酚、β-谷甾醇以及儿茶素，说明这三种成分可能在白芍抗血吸虫病及肝纤维化中起重要作用。

图2 药物—成分—靶点—疾病网络图Fig.2 Drug-component-target-disease network

2.4 PPI网络构建及关键靶点的筛选结果为了进一步说明16个白芍抗血吸虫病及肝纤维化共同靶点之间的相互作用，将16个与白芍抗血吸虫病及肝纤维化相关的潜在基因导入STRING数据库得到共同靶点基因编码蛋白质互作网络（图3）。利用R语言处理STRING数据库所得tsv文件，得到蛋白质互作网络相关核心基因的条形图，同时获得核心靶点基因名称（图4）。可以看出，JUN、PTGS2和CAT等基因可能是重要的靶点。

图3 白芍抗血吸虫病及肝纤维化靶点的蛋白质-蛋白质互作网络图Fig.3 Protein-protein interaction network of targets of Paeonia lactiflora Pall against schistosomiasis and liver fibrosis

图4 蛋白质互作网络核心基因条形图Fig.4 The bar diagram of core genes of the protein-protein interaction network

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果通过对白芍抗血吸虫病及肝纤维化共同靶点进行GO和KEGG富集分析，GO富集分析显示16个共同靶点在生物过程（BP）方面主要包括活性氧代谢过程、脂多糖的反应、脂肪酸合成代谢以及对细菌来源分子的反应和药物反应等；细胞组成（CC）主要涉及核被膜、细胞器外膜、膜筏以及膜微结构域等；分子功能（MF）主要涉及血红素结合，四吡咯结合、多肽结合、酰胺结合以及氧化还原酶和过氧化物酶活性等（图5）。KEGG富集分析显示16个共同靶点主要参与脂质和动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、细胞色素P450对药物的代谢作用、小细胞肺癌、NF-kappa B信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等信号通路（图6）。

图5 GO功能富集分析Fig.5 GO functional enrichment analysis

图6 KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis

3 讨论

肝纤维化是由病毒感染、血吸虫病和酒精中毒等多种因素引起的慢性肝损伤，但其确切的病理机制尚不清楚［8］。虽然多种药物在体外细胞和动物模型中显示具有抗纤维化活性，但临床上迄今为止还没有有效的抗肝纤维化治疗的药物。有研究表明，白芍中的白芍总苷具有多种保肝作用［9］，并且其中的有效成分芍药苷对曼氏血吸虫诱导的小鼠肝纤维化具有一定的缓解作用［10］，但是其具体的分子机制尚不清楚。因此，筛选和确定白芍抗血吸虫病及肝纤维化的治疗靶点十分重要。

本研究基于网络药理学的方法筛选出山奈酚、β-谷甾醇以及儿茶素是白芍中发挥药效的潜在活性成分。山奈酚通过下调IL-13和COL1基因表达，抑制胶原蛋白合成，同时上调MMP-2基因表达而促进胶原分解，发挥治疗血吸虫肝纤维化的作用［11］。肝纤维化与胶原蛋白和α-SMA表达水平的升高密切相关，β-谷甾醇能够下调活化的肝星状细胞中胶原-1和α-SMA的mRNA水平和蛋白质表达水平，口服β-谷甾醇能有效缓解肝纤维化模型小鼠的肝损伤并且防止胶原积累［12］，这种调节作用表明该药物可能是一种潜在的肝纤维化治疗药物。乙型肝炎和丙型肝炎是发生在肝脏最常见的病毒性疾病，它们会引起广泛的炎症并导致肝损伤。儿茶素及其衍生物对人类免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等多种病毒具有抗病毒活性［13］，提示其对嗜肝病毒具有抗感染潜力。蛋白质互作网络核心基因条形图表明，JUN、PTGS2和CAT等连接度高的基因靶点可能是白芍抗血吸虫病及肝纤维化的重要靶点。有研究报道，抑制GSK-3β能够诱导JUN的激活从而上调骨桥蛋白的表达，加速了慢性肝病患者胆汁淤积性肝纤维化的进展［14］。PTGS2负责前列腺素生物合成，参与炎症和有丝分裂，PTGS2可能还与NF-kappa B信号通路的激活有关［15］，并且PTGS2是非甾体类抗炎药物的重要靶点，下调PTGS2的表达有助于减少炎症反应［16］。CAT基因编码过氧化氢酶，过氧化氢酶是人体抵御氧化应激的关键抗氧化酶［17］。肝纤维化会逐渐导致抗氧化成分（过氧化氢酶）的减少和氧化应激的增加，提高抗氧化分子（过氧化氢酶）表达能够改善肝纤维化［18］。

GO富集分析显示，白芍抗血吸虫病及肝纤维化的16个靶点主要参与活性氧代谢过程，脂多糖的反应，药物反应以及酶活性等。KEGG富集分析显示16个靶点主要参与脂质和动脉粥样硬化、糖尿病及其并发症中的AGE-RAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、细胞色素P450对药物的代谢作用、小细胞肺癌、NF-kappa B信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等信号通路。此外，这些靶标也富集在一些癌症和病毒感染信号通路，如小细胞肺癌和卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染，这可能是因为一些癌症和病毒感染与肝纤维化具有相同的信号通路。

本研究基于网络药理学的思路和方法，充分展现了白芍通过多靶点、多成分、多通路发挥抗肝纤维化及血吸虫病的作用机制，为深入探讨白芍抗血吸虫病及肝纤维化的药理机制提供了新的方向与线索。但本研究中发现的关键靶点和通路仍需要进一步通过实验进行验证和探究。