细辛多糖提纯、保润和热裂解产物研究及应用

张皓楠，金桂勇，席高磊，杜佳，张晓平，刘鹏飞，王小莉

(1.河南农业大学烟草学院，河南 郑州 450002；2.河南中烟工业公司技术中心，河南 郑州 450016；3.河南牧业经济学院动物医药学院，河南 郑州 450046)

保润剂是一类具有较强从环境中吸收水分和保持水分能力的物质，在烟草、食品等方面均有广泛应用[1]。烟草保润剂从烟叶采收、运输、贮存及整个生产销售过程中可以有效地保持烟叶水分，对烟叶破碎、霉变、减少烟气刺激性、增加烟气舒适感等方面起着重要作用[2]。烟草领域传统保润剂甘油、丙二醇等在卷烟燃吸时会形成焦油、苯酚等致癌物质，同时会产生一定的刺激性[3]、干燥感[4]。因此，寻找高效且能够改善卷烟品质的新型烟草保润剂成为行业发展的重要课题。近年来，天然多糖在烟草保润方面的应用成为了研究的热点。

多糖是由多种单糖聚合成的天然高分子化合物。近年来研究发现，其具有保润、吸湿、降糖、免疫调节、抑制肿瘤、抗氧化等重要生物活性[5-6]。此外，多糖中含有大量的羟基等亲水基团，可与水分子紧密结合，对烟草具有较好的保润作用；同时，多糖在高温条件下裂解可以产生大量对烟气有益的有机物，可以起到一定的增香效果[7-8]。如李永齐等[9]对比了白鬼笔菌托(Phallusimpudicus)多糖、银耳(Tremellafuciformis)多糖、蛹虫草(Cordycepsmilitaris)多糖、花脸香蘑(Lepistasordida)多糖和蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyceshepiali)多糖保润效果，保湿性均低于甘油，防潮效果均高于甘油，其中白鬼笔菌托多糖具有较好的保湿性能和较好的防潮效果；黄芳芳等[10]分别提取了铜藻(Sargassumhorneri)多糖水提物、醇提物、径向流色谱脱蛋白提取物、化学法脱蛋白提取物并添加至烟丝中，测得铜藻多糖在低湿和高湿条件下均可减缓烟丝水分的变化，热裂解产物识别出糠醛类、酮类等物质，使得添加铜藻多糖后的卷烟品质上升，证明了铜藻多糖是一种天然保润剂；刘珊等[11]通过热裂解产物研究裙带菜(Undariapinnatifida)多糖对卷烟感官质量的影响，发现加入裙带菜多糖后的卷烟杂气降低，刺激性降低，烟气细腻度提高，回甜舒适感增强。目前，多糖对卷烟保润增香研究多只考察其保润性或热裂解产物，多糖的保润性、热裂解产物及其添加至卷烟中的评吸评价相关研究较少。

因此，本研究选用北细辛(AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum (Maxim.)Kitag.，简称Asarum)作为研究对象，对其进行提取、脱蛋白、分离纯化，通过紫外-可见光谱、红外光谱、扫描电镜对分离纯化组分进行鉴定；通过将其喷施于烟丝考察其对烟丝的保润性，并分析其热裂解产物卷烟评吸评价，以期为细辛多糖在卷烟中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

细辛：市购北细辛；无水乙醇(C2H6O)、浓硫酸(H2SO4)(烟台市双双化工有限公司，AR)；氯化钠(NaCl)、氢氧化钠(NaOH)、苯酚(C6H6O)、甘油(C3H8O3)(天津市大茂化学试剂厂，AR)；溴化钾KBr(天津市大茂化学试剂厂，GR)；DEAE-52(北京索莱宝科技有限公司，AR)。

BSZ-160F自动部分收集器，上海之信仪器有限公司；UV-5200紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪，Thermo Nicolet Co；S-3400扫描电镜，Hitachi Limited；5250-T热裂解仪，CDS Analytical；Agilent 7890B-5977A气相色谱质谱联用仪，Agilent Technologies。

1.2 试验方法

1.2.1 细辛粗多糖的制备 细辛粗多糖ASPs的制备采用水提醇沉法。取细辛干品(过0.3 mm孔径筛)，m(料/g)∶V(液/L)=1∶0.01，提取温度为60 ℃，提取时间1 h，提取3次合并提取液并浓缩，离心去沉淀后加入无水乙醇至V(提取液)∶V(乙醇)=1∶3，4 ℃环境下醇沉过夜，离心后取沉淀物，沉淀物用适量水复溶后，用截留相对分子质量为3 500 Da的透析袋透析72 h。透析后多糖水溶液冷冻干燥即得细辛粗多糖。

1.2.2 细辛粗多糖的分离纯化 细辛粗多糖的分离纯化，先使用Sevag法脱蛋白3次，再通过DEAE-52纤维素层析柱(16 mm×470 mm)进一步分离纯化，参考文献[12-13]的方法进行。

1.2.3 细辛多糖的紫外扫描 称取细辛多糖用水配置成质量浓度为0.5 g·L-1的溶液，使用紫外-可见分光光度计在190～500 nm波长范围内进行扫描。

1.2.4 细辛多糖的红外光谱 称取0.002 g细辛多糖和0.1 g溴化钾粉末混合，在干燥干净的玛瑙研钵中研磨均匀，烘干后用压片机压片。用傅里叶变换红外光谱仪在4 000～500 cm-1的范围内进行扫描。

1.2.5 细辛多糖扫描电子显微镜 采用扫描电镜观察细辛多糖的微观表面形貌。

1.2.6 细辛多糖烟草保润性分析 参考王小莉[13]的方法，选用云烟97等级C3F的单料烟丝，将烟丝置于温度为22 ℃、湿度为60%的条件下平衡水分48 h。称取5组10 g烟丝，对每组分别喷施1 mL配置好的0.1 g·L-1的ASP1、ASP2、ASP3和质量浓度为0.1 g·L-1的甘油，喷施纯水为对照；将处理后的烟丝上述条件下再平衡水分48 h，备用。

保湿性试验：取上述处理后的烟丝，每组分为3份。置于22 ℃、相对湿度为40%的恒温恒湿箱中保持低湿条件，0、6、12、24、36、48、72、96、120 h定时称量烟丝质量。烘箱烘干后称其干质量，按以下公式计算含水率(W)。

式中：m0为某时间点烟丝样品的质量/g；m为烟丝样品的干质量/g。

吸湿性试验：同上操作，将烟丝置于温度22 ℃，相对湿度70%的恒温恒湿箱中保持高湿条件，记录烟丝质量随时间的变化，按上述公式计算含水率。

1.2.7 细辛多糖热裂解产物分析 按照张翼飞等[14]的方法，取适量干燥的多糖样品放入石英管中，用石英棉堵住两端，随后将石英管放入热裂解仪中，选用300、600和900 ℃，在氦气气氛中进行无氧裂解试验。

1.2.8 感官评吸质量评价 参考刘珊等[11]的方法，选用糖含量最高的组分ASP3添加至单料烟丝。烟丝先在温度22 ℃，相对湿度60%的恒温恒湿箱中平衡水分48 h，多糖用纯水稀释后按0.2、0.4、0.6、0.8 g·kg-1添加至烟丝，以添加纯水为对照(CK)。添加后再平衡水分48 h。手工卷制后进行感官评吸评价，采用“九分制”对10个指标进行打分。

2 结果与分析

2.1 细辛粗多糖的分离纯化

DEAE-52纤维素层析柱为阴离子交换柱，使用不同浓度的NaCl溶液洗脱，可以根据所带电荷的强弱将样品分离成不同组分。由图1可知，细辛粗多糖经0、0.2、0.3 mol·L-1的NaCl洗脱得到3个多糖组分，将其命名为ASP1、ASP2、ASP3。3个组分吸光值存在差异，ASP3的吸光值相对较高，说明了其糖含量较高；3个组分峰型均较窄，无明显拖尾，纯度较高。

图1 细辛多糖的DEAE-52纤维素柱洗脱曲线Fig.1 Elution curve of ASPs on DEAE-52 cellulose column

2.2 细辛多糖的紫外全波长扫描

图2为细辛多糖分离纯化后的3个组分及细辛粗多糖的紫外扫描光谱图。对ASP1、ASP2、ASP3和细辛粗多糖在190～500 nm的波长范围内进行了紫外扫描。检测其在260、280 nm波长处是否含有核酸和蛋白质缀合物吸收峰[15]。从图2中可以看出，细辛多糖均为末端吸收，细辛粗多糖在260～280 nm处存在吸收峰，而3个组分在260和280 nm处均无明显的紫外吸收。3个组分与碘反应未变蓝，说明均为非淀粉。

图2 细辛多糖的紫外全波长吸收光谱Fig.2 UV full-wavelength absorption spectrum of ASPs

2.3 细辛多糖的红外光谱

图3 细辛多糖的红外光谱图Fig.3 FT-IR spectrum of ASPs

2.4 细辛多糖扫描电子显微镜

图4为ASP1、ASP2和ASP3在3 000倍条件下电子扫描显微镜图，由图可知ASP1表面粗糙，像干裂的土层，类似于海绵结构，存在明显孔洞及致密无孔区域；ASP2呈不规则丝状，结构疏松多孔；ASP3结构较为致密，层次不一，呈无规则压合片状。

图4 ASPs 扫描电子显微镜图Fig.4 SEM of ASPs

2.5 细辛多糖在卷烟保润性中的应用

在低湿(相对湿度40%)条件下考察细辛多糖保湿性，喷施甘油、ASP1、ASP2、ASP3及纯水的烟丝含水率随时间变化(图5)。由图5可知，前24 h各处理烟丝含水率均下降较快，喷施ASP1、ASP2和ASP3的处理慢于喷施纯水的对照处理快于甘油处理；24～48 h各处理含水率下降变慢；48 h后各处理含水率变化趋于稳定。总体上ASP1、ASP2和ASP3保湿效果优于对照，劣于甘油，其中细辛多糖分离组分保湿性ASP3>ASP1>ASP2。说明在干燥环境下，细辛多糖具有一定保湿性。

图5 不同处理的烟丝在低湿条件下含水率随时间的变化Fig.5 The change of moisture content of tobacco with time in low humidity conditions

在高湿(相对湿度70%)条件下考察细辛多糖吸湿性，喷施甘油、ASP1、ASP2、ASP3及纯水的烟丝含水率随时间变化如图6所示。由图6可知，前24 h各处理烟丝含水率均上升较快，24～48 h上升变慢；48 h后含水率变化趋于稳定。趋于稳定后，喷施ASP1、ASP2和ASP3处理的烟丝含水率低于甘油处理，且对照

图6 不同处理的烟丝在高湿条件下含水率随时间的变化Fig.6 The change of moisture content of tobacco with time in high humidity conditions

2.6 细辛多糖热裂解产物分析

烟支在燃烧过程中发生着多种化学反应，主要发生在燃烧锥区域，温度一般为700～900 ℃，甚至可达1 000 ℃以上，该区域内有机物在高温缺氧环境下发生热解、聚合等化学反应；燃烧锥附近温度为100～700 ℃[22-23]，因此本试验选用代表性的300、600和900 ℃作为细辛多糖热裂解研究温度，并选用氦气模拟无氧环境(表1)。

表1 不同温度下ASP1、ASP2和ASP3的热裂解产物Table 1 Pyrolysis products of ASP1,ASP2 and ASP3 at different temperatures %

在300 ℃时，由于温度较低，ASP1裂解不充分，裂解产物很少。ASP1裂解产物仅有8种。其中主要有糠醛类含量为28.72%，酮类含量为1.35%；600 ℃下，裂解产物为27种，主要有糠醛类为26.81%，酮类5.05%，呋喃类6.32%，吡啶类1.8%；900 ℃下，裂解产物为36种，主要有糠醛类为21.63%，酮类9.88%，呋喃类6.56%，吡啶类1.88%。

与ASP1的热裂解产物类似，在300 ℃下ASP2和ASP3的裂解产物很少，均只有7种。主要有糠醛类、酮类和呋喃类等，其中糠醛类含量分别为36.18%和23.27%，酮类含量分别为2.33%和1.29%；600 ℃下分别识别出31和36种，主要有糠醛类、酮类、呋喃类、吡啶类等，其中糠醛类含量分别为30.12%和13.12%、酮类含量分别为6.8%和20.62%、呋喃类含量分别为4.4%和3.48%、吡啶类含量分别为2.23%和1.55%；900 ℃下分别识别出37和41种，其中主要产物糠醛类含量分别为21.01%和8.32%、酮类含量分别为11.64%和21.77%、呋喃类含量分别为4.87%和4.95%、吡啶类含量分别为2.41%和2.05%。

综上所述，不同温度下ASP1、ASP2和ASP3的裂解产物存在一定差异，ASP1共产生44种、ASP2共46种、ASP3共47种，3个组分均产生了糠醛类、吡啶类、酚类、酯类等物质。这些物质对提高卷烟的香气量、减轻杂气等方面有较优的作用。

2.7 细辛多糖在卷烟感官评吸质量中的评价

对添加了不同添加量的细辛多糖的烟丝进行感官评吸质量评价(表2)。由表2可知，添加细辛多糖对卷烟香气质和香气量有提升，同时杂气有一定的减轻，香气有改善；减少刺激，余味略有提升，甜味增加，口感改善；浓度和劲头变化不大；燃烧性和灰分和CK相比，没有变化。其中0.4和0.6 g·kg-1添加量的处理，评吸效果相对较好。

表2 添加细辛多糖烟叶感官质量评价Table 2 Sensory quality evaluation of tobacco leaves with ASPs addition 分

3 讨论与结论

本研究从细辛中成功分离纯化出了ASP1、ASP2、ASP3 3个组分。紫外扫描结果显示，3个组分的紫外光谱曲线平滑，无明显吸收峰，表明ASP1、ASP2和ASP3中核酸和蛋白质等杂质已基本去除完全，与红外扫描结果一致。3个组分与碘反应未变蓝，说明3个组分均为非淀粉。红外分析表明，3个组分均具有多糖特征峰，均为非淀粉多糖。扫描电镜分析表明，ASP1、ASP2和ASP3结构上均有较好的聚集性，做为保润剂时可以更好地在烟丝表面形成网状或膜状结构[24]。

细辛多糖各组分均有一定的保润性和防潮效果，与杨君等[8]对裂片石莼多糖、黄芳芳等[10]对铜藻多糖和王小莉[13]对香加皮多糖等研究结果一致。细辛多糖在低湿条件下保润性能均劣于甘油优于纯水，高湿条件下防潮效果均优于甘油，且ASP1、ASP2和ASP3的保润性和吸湿性无明显差异。多糖因具有较多的羟基、羧基等亲水性基团，当与水接触时可以形成氢键从而吸附水分，同时能够在烟丝表面形成网状或膜状结构，从而减少烟丝内部水分的散失。但影响多糖保润性的因素很多，如多糖分子质量、物理性质、载体物理结构等[25]。同时扫描电镜图表明，ASP1、ASP2和ASP3之间保润性的差异，可能是因为其不同的构象结构导致。甘油保润性优于细辛多糖的原因可能是细辛多糖分子中的羟基呈游离态的较少，与水的结合性比甘油弱[26]。细辛多糖在防潮方面优于甘油的原因，可能是因为在高湿条件下水分子与细辛多糖中的羧基结合形成了网状结构，在烟丝表面形成了一层薄膜，这层薄膜有效的阻碍了水分子继续进入烟丝；同时甘油中的亲水基团羟基或羧基更容易与水形成氢键而易于吸收环境中的水分[27]，但具体机制还需要进一步探究。

对于多糖的热裂解产物及其在烟草中的应用，刘珊等[11]对裙带菜多糖、张翼飞等[14]对香加皮多糖及许春华等[28]对香料烟烟叶多糖的热裂解产物等研究均表明，多糖的热裂解产物中含有对烟草有益的致香物质。细辛多糖的热裂解产物，随着裂解温度的升高，ASP1、ASP2和ASP3中小分子量的易挥发性物质先挥发，大分子物质开始分解，同时小分子物质由于受热会发生聚合、缩合等复杂的反应[29]。随裂解温度的升高，糠醛类物质相对含量均有所下降；而酮类、呋喃类、吡啶类含量有所上升，可能是由于温度升高，糠醛类物质裂解、重排形成如酮类及一些杂环类小分子物质，之所以有含氮化合物可能是蛋白质残留造成的。类似地，黄芳芳等[10]对铜藻多糖以及王全等[30]对枸杞多糖在无氧环境下的热裂解产物进行分析，结果发现产物中也含有一定的含氮化合物。ASP1、ASP2和ASP3热裂解产生的杂环类物质，主要有吡啶、吡咯、吲哚等化合物，这类物质可能是葡萄糖、半乳糖等残基分解的产物，此类物质一般具有焦香、焦甜香香味，卷烟中常添加的美拉德反应产物同属此类物质，可以提高卷烟香气量[31]；酮类、醛类、酯类和酸类化合物一般具有甜香、果香香味，在卷烟中有醇和烟气的作用[28]；酚类物质可以产生酚香和药草香气，也是烟草和烟气中的常见物质[32]。卷烟中添加细辛多糖，通过感官评吸评价分析，结果表明，添加一定量的细辛多糖有助于丰富卷烟香气提高香气量，改善烟气质量提高香气质，在减少刺激性方面也有明显提高。不同添加量感官质量存在一定差异，0.4和0.6 g·kg-1的添加量较为适宜。类似地，刘珊等[11]和徐春华[33]等分别将裙带菜多糖和柽柳核纤孔菌发酵多糖添加至卷烟进行感官质量评价，卷烟中添加一定量的多糖可以改善烟气质量。

本研究采用DEAE-52离子交换柱分离出ASP1、ASP2和ASP3。发现3个组分在低湿和高湿条件下均具有一定的保润和防潮效果，其裂解产物中均含有对卷烟质量有益的成分，并且感官质量评价也表明了卷烟中添加一定量的细辛多糖有助于丰富卷烟香气，改善烟气质量。综上可知，细辛多糖对烟草具有一定的保润性，且可裂解对烟草有益的致香物质。虽然现有的研究已证明多糖的加入可以对卷烟品质产生保润增香的效果，但是其在卷烟中的应用目前还比较少，对于细辛多糖添加至卷烟，燃烧过程中产生物质及其产生的影响还需进一步探究。