基于网络药理学技术探讨麻子仁丸治疗便秘的作用机制

花 卉 刘 聪 何宇霞 林建翠 吴 琼 倪 艳 郝旭亮

（1.山西省中医药研究院方剂研究所，山西 太原 030012；2.山西中医药大学中药与食品工程学院，山西 太原 030012；3.山西中医药大学附属医院院长办公室，山西 太原 030012）

便秘是指粪便在肠道内滞留过久，秘结不通，排便周期延长，或粪质干硬难排，或欲便不畅[1]。中医对便秘的治疗，是遵循中医的整体观念与辨证论治相结合的原则，依据中医理论进行辨证论治[2，3]，对人体脏腑阴阳、寒热虚实等进行整体调理，以取得良好的临床疗效，其中麻子仁丸便是常用方之一。麻子仁丸所治在《伤寒论》中被称为脾约证，即胃强脾弱，脾不能为胃行其津液，津不四布，输于膀胱，而致小便数，大便秘。

网络药理学是利用网络分析，通过各种数据库检索，找到并建立疾病、靶点、药物之间的相互作用网络，进而实现从系统水平研究药物与机体相互作用规律和机制。中药复方中药材多、成分复杂、作用机制不清楚[4-6]。我们可以利用网络药理学对中医药进行研究，系统地观察药物对疾病网络的干预与影响，揭示药物治疗作用的分子机制，使得中医药有更好的发展前景[7]。

1 材料与方法

1.1 麻子仁丸活性成分的筛选 使用TCMSP数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）以及搜索相关文献，分别收集枳实、厚朴、大黄、麻子仁、杏仁、白芍中主要的化学成分，以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件，对收集到的化学成分进行ADME分析，筛选出麻子仁丸中的有效活性成分，再结合明确报道有生物活性的化合物，建立麻子仁丸化学成分数据库。

1.2 活性成分潜在作用靶点的预测与疾病靶点的收集 使用药物靶点分析平台[8]PharmMapper网（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html），预测其靶点。然后将所得到的靶点信息输入到Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）中，并限定物种为人类，将所有靶点名称校正为该靶点的基因名称。在GeneCards数据库（http：//www.genecards.org/，Version4.5.0），以“constipation”为关键词搜索疾病相关基因，得到便秘疾病相关靶点。

1.3 活性成分-作用靶点-疾病网络的构建 根据麻子仁丸中主要有效成分预测的靶点，建立活性成分-作用靶点-疾病之间的相互对应关系，使用Cytoscape3.7.0软件中，构建“活性成分-作用靶点-疾病”网络。

1.4 蛋白质相互关系网络的构建 将麻子仁丸及便秘疾病的蛋白靶点导入String数据库，获取蛋白之间的相互作用关系，将蛋白相互作用信息导入Cytoscape 3.7.0绘制相互作用网络，获得麻子仁丸作用靶点蛋白-蛋白相互作用网络图。

1.5 基因功能和信号通路分析 将麻子仁丸治疗便秘共同的关注基因导入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp），限定物种为人，对关注基因进行Gene Ontology分析和Pathway分析[9]，按照涉及的靶点数目多少进行排序，筛选排名靠前的生物过程或信号通路。

2 结果

2.1 麻子仁丸中活性成分的筛选 通过对TCMSP数据库以及文献检索，从白芍、大黄、厚朴、火麻仁、杏仁、枳实中分别收集主要的化学成分。以OB≥30%和DL≥0.18作为活性成分筛选标准，对收集到的化学成分进行ADME分析，去重后共得到活性成分42个，白芍7个、大黄11个、厚朴3个、火麻仁5个、杏仁12个、枳实12个。

2.2 潜在靶点的预测与疾病靶点的收集 麻子仁丸中的42个活性成分通过Pharm-Mapper分析平台预测出399个作用靶点，将靶点名称输入到Uniprot数据库校正为该靶点的基因名称。通过与GeneCards数据库获取与便秘相关的靶点2016个，将预测得到的疾病的靶点与药物的靶点放入Omicshare数据库中，取二者的交集，共得到71个基因靶点。把71个共同的基因作为关注基因。见图1。

图1 麻子仁丸药物和疾病的交集基因

2.3 活性成分-作用靶点-疾病网络的构建 将麻子仁丸中活性成分、作用靶点及疾病的信息导入Cytoscape 3.7.0软件构建麻子仁丸治疗便秘的“活性成分-作用靶点-疾病”网络。最外圈矩形节点代表活性成分，中间圆形节点代表作用靶点，边代表活性成分和作用靶点之间的相互作用关系。网络图表明同一活性成分对应不同的作用靶点，同一作用靶点也可对应于不同的活性成分，显示出麻子仁丸治疗便秘的多成分、多靶点的特点。见图2。

图2 麻子仁丸活性成分-作用靶点-疾病网络图

2.4 蛋白质相互作用关系网络的构建 将上述作用靶点基因名导入String数据库，开始分析蛋白互作用关系，再使用Cytoscape 3.7.0软件绘制蛋白相互作用网络。图中节点表示蛋白，边表示蛋白-蛋白之间的相互作用关系。节点的大小和颜色表示Degree值[10]的大小，节点越大，颜色由浅变深对应的Degree值越大。见图3。

图3 麻子仁丸药物活性成分靶点与疾病靶点的PPI网络

2.5 基因功能分析 使用DAVID数据库对麻子仁丸治疗便秘的共同靶点进行GO和Pathway分析，阈值设置为P＜0.05，筛选靠前的生物过程。通过GO分析有可能找到导致性状发生变化的重要功能，并且找到该功能对应的基因。BP分析中靠前的有细胞内信号转导（Intracellular signal transduction）、T细胞共刺激（Tcell costimulation）、参与吞噬作用的Fc-γ受体信号通路（Fc-gamma receptor signaling pathway involved in phagocytosis）、血管内皮生长因子受体信号通路（vascuar endothelial growth factor receptor signaling pathway）、MAPK级联（MAPK cascade）等。见图4。

图4 麻子仁丸治疗便秘潜在靶点的生物学过程的GO分析

2.6 信号通路分析 信号通路分析是多个蛋白质之间相互作用，共同调节细胞功能和代谢活动的过程。其中关键靶蛋白的KEGG通路富集分析结果所示，关键靶蛋白主要排名靠前的是PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、蛋白聚糖在癌症中（Proteoglycans in cancer）、局灶性粘连（Focal adhesion）等通路，进一步表明麻子仁丸治疗便秘是通过多成分、多通路的整合作用。见图5

图5 麻子仁丸治疗便秘KEGG的前20个富集通路

3 讨论

本实验通过检索相关数据库和文献，对收集到的化学成分进行分析，筛选出42种可能的主要活性成分，然后筛选得到71个与便秘相关的作用靶点，成分-靶点-疾病图与蛋白质相互作用网络图的结果表明麻子仁丸治疗便秘是多成分、多靶点复杂交互起作用而非起单一作用。作用靶点KEGG通路分析结果可以看出，麻子仁丸治疗便秘主要涉及的通路为PI3K-Akt、蛋白聚糖在癌症中、局灶性粘连等信号通路。PI3K/Akt通路可以调节细胞生长和蛋白质合成，抑制细胞的凋亡[11]。有研究表明PI3K-Akt表达降低，可使结肠组织NO和eNOS含量增多，eNOS是NOS（一氧化氮合酶）的表达类型之一，NOS负责产生NO，NO是一种消化道抑制性神经递质，其作用于胃肠道平滑肌，可以抑制平滑肌收缩，从而减少胃肠道的蠕动[12]。在后续研究中试验验证中PI3K/Akt通路可以作为关注的重点通路。

综上所述，网络药理学基于“药物-成分-靶点-疾病”相互作用的网络，系统地观察药物对疾病的干预与影响，对麻子仁丸治疗便秘的作用机制通过网络药理学的方法进行整理和分析，揭示其化学成分与相关靶标的相互作用。通过蛋白质间相关作用网络筛选的麻子仁丸治疗便秘的核心靶基因可进一步通过实验深入探究具体机制。