血清总胆红素重氮盐法和钒酸盐氧化法测定方法的比较

郭晶晶 孟超 刘茜

摘要：胆红素是血红蛋白的代谢产物，主要涉及肝脏代谢，血清胆红素水平是肝胆疾病的重要诊断指标。体内的胆红素包括直接胆红素、间接胆红素，二者之和称为总胆红素，临床对胆红素的生化检测有多种方法，本文使用重氮盐法和钒酸盐法对血清总胆红素进行测定，比较两种方法检测结果的差异。实验结果发现，两种方法的重复性和准确度均能满足临床要求，钒酸盐法的准确度高于重氮盐法。

关键词：胆红素代谢  胆红素测定方法  重氮盐法  钒酸盐法  方法比较

肝脏是人体最大的实质性器官，具有复杂而重要的生理功能，参与代谢是肝脏最主要的功能。肝脏参与三大营养物质的代谢过程：肝脏可以合成蛋白质，亦可以分解蛋白质。人体有超过40%的蛋白质是在肝脏合成的，血浆白蛋白则完全由肝脏合成。肝脏细胞含有蛋白质脱氨酶和转氨酶，从而分解蛋白质，氨进一步转变成尿素排泄。人体摄入的糖类在肝脏转变为葡萄糖，当血糖浓度升高时，血糖可转变成葡萄糖聚合物以糖原的形式贮存于肝脏，当血糖浓度降低时，肝糖原可以迅速分解成葡萄糖，向人体供能，从而保持血糖的稳定。当人体摄入的糖类物质较少时，肝脏可以将氨基酸、丙酮酸等非糖类物质转变成肝糖原，以满足机体对葡萄糖的消耗。肝脏可以合成胆固醇，胆固醇转变成胆汁酸盐，胆汁酸盐使脂肪乳化成微粒，脂肪微粒可被身体吸收。脂类物质可直接与肝脏中的蛋白质结合成脂蛋白。肝脏参与维生素的代谢。一些脂溶性维生素可长期大量储存于肝脏中，如维生素A、维生素D、维生素B12的储存量可满足几个月甚至是一两年的使用。肝脏中可形成有多种凝血因子，如凝血因子I。同时，肝脏可形成抗凝血因子，如肝素。因为肝脏的体积大，可以贮存的血量多，因此肝脏也是主要的贮血器官[1]。肝脏是已知的最重要的解毒场所，内源性毒物，如激素、血氨等，以及外源性毒物，如药物、毒物等，均可在肝脏转化，降低毒性或解毒后，随尿液、胆汁等途径排出体外。

肝脏的再生和代偿能力很强，切除部分肝脏，肝功能不受影响，剩余肝细胞通过再生使肝脏恢复完整。但是肝脏也是很敏感和脆弱的，当肝功能发生紊乱时，会对人体健康产生各种影响，严重者可危害生命。已知多种物质均可引起肝功能异常，如酒精、病毒、化學药物和有毒物质，肝细胞损伤后可产生各种肝脏疾病，包括酒精性肝病、慢性病毒性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝病等[2]。

血清生化检查是临床常用的肝功能检测项目，包含多种检测指标，如反映肝细胞损伤的ALT、AST和GGT，反映肝脏合成功能的白蛋白、凝血酶原时间、肝纤维化的透明质酸、IV型胶原，以及反映胆红素代谢的总胆红素、直接胆红素和间接胆红素。通过分析生化指标与正常值的偏离程度，有助于对肝脏相关疾病的鉴别诊断及治疗药物和方案的选择等[3]。

胆红素主要来源于衰老的红细胞，其中的血红蛋白代谢产生，此部分占胆红素总量的80%左右，其余少量的胆红素来源于其他含血红素的蛋白，如肌红蛋白、细胞色素P450等。血红蛋白在组织蛋白酶的作用下，分解产生亚铁血红素，亚铁血红素经微粒体酶等作用形成胆绿素，胆绿素经胆绿素还原酶作用形成游离胆红素[4]，即间接胆红素。

肝脏是胆红素主要代谢场所，胆红素的代谢包含多个环节，即肝细胞对血液中胆红素的摄取和转运，间接胆红素转化为直接胆红素，直接胆红素经胆汁排泄，这一系列的过程相互连接和影响，任何一个环节发生障碍，均可导致胆红素的代谢异常[5]。血清胆红素水平反映了肝脏细胞对胆红素摄取、结合和排泄的能力。血清胆红素包括总胆红素、直接胆红素和间接胆红素。当肝功能受损时，肝脏对胆红素的代谢能力下降，血清胆红素浓度升高。临床上将血清胆红素水平作为肝胆疾病和溶血疾病鉴别诊断的重要指标[6]。总胆红素增高，同时直接胆红素和间接胆红素也增高，常见于肝细胞性黄疸，如急性黄疸型肝炎、重症肝炎、慢活肝、肝硬化等疾病。总胆红素和直接胆红素升高，常见于阻塞性黄疸，如胆道结石、胆道梗阻等疾病。总胆红素和间接胆红素升高，常见于溶血性黄疸和遗传性疾病[7]。

临床对胆红素的测定有多种方法，目前市面上常见的测定总胆红素的试剂盒，主要包括两种方法学，即重氮盐法和钒酸盐法。重氮盐法是最早被发现使用的，且是全国医学检验学会推荐的方法，具有较高的灵敏度、准确度和精密度，线性范围较宽，基本能满足临床使用需求，但是重氮法有其局限性，试剂稳定性较低，受干扰因素多，溶血对检测准确度影响尤其严重。随着技术的发展，多种胆红素检测方法被发现，钒酸盐法是其中性能比较好且被普遍选择的一种方法[8]。本文采用了同一家公司生产的两种方法学的胆红素测定试剂盒，对胆红素国家标准物质进行测定，对实验结果进行比较，以此分析两种方法学对检测结果的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

北京九强生物技术股份有限公司生产的：总胆红素测定试剂盒（重氮盐法）（批号：200326）及配套临床化学校准血清（批号：190201）和定值多项质控血清（批号：190929）;总胆红素测定试剂盒（钒酸盐氧化法）（批号：200526）及配套临床化学校准血清（批号：190201）和定值多项质控血清（批号：190929）。中国食品药品检定研究院研制的：总胆红素冰冻人血清国家标准品（批号：360033-201901），水平1：（7.01±0.28）?mol/L和水平2：（27.10±0.54）?mol/L。

1.2 仪器

日立7180型全自动生化分析仪。

1.3 方法

重氮盐法在7180上主要参数如下。主波长：546 nm，副波长：660 nm，试剂1量：160 ?L，试剂2量：40 ?L，样品量：8 ?L，方法：2 point end。钒酸盐法在7180上主要参数：主波长：450 nm，副波长：546 nm，试剂1量：224 ?L，试剂2量：56 ?L，样品量：8 ?L，方法：2 point end。使用临床化学校准血清校准仪器，测定定值多项质控血清，质控测定值符合要求后，测试样本。总胆红素冰冻人血清国家标准品两个浓度水平，避光恢复至室温后，取适量用于测定，每个水平各测定10次。BE7B49A7-BB89-4384-B0BD-08972D762372

2 实验结果

2.1 准确度实验

测定结果的平均值（X）与标准品靶值的相对偏差（RD），如表1所示。

实验结果显示，重氮盐法测定结果与标准品靶值的相对偏差均大于±10%，钒酸盐法测定结果与标准品靶值的相对偏差均小于±5%，说明钒酸盐法的准确度更好。

2.2 重复性实验

测定结果的平均值（X）、变异系数（CV），如表2所示：

实验结果表明，两种方法测定的精密度良好，CV均小于10%，两种方法测定水平2的CV均小于水平1，说明高浓度样本相对于低浓度样本，受到的干扰更小，因此精密度更好。

3 讨论

随着科技的发展和技术的进步，临床检测水平不断提升，不仅是检测仪器更加智能化、自动化和高通量化，检测试剂也逐步变得更为精准、快捷、无毒和高效，同时为了适应市场竞争，试剂成本也需要不断降低。

本次实验采用的是北京九强生物技术股份有限公司生产的两种试剂盒。重氮盐法的检验原理为：在酸性条件下，胆红素与重氮化二氯苯胺发生偶联反应，生成有色偶氮化合物，其生成量与总胆红素的浓度成正比，偶氮化合物在中性溶液中呈现红色，在酸性和碱性溶液中呈现蓝色[9]。钒酸盐法的检验原理为：在pH值为3的条件下，界面活性剂与钒酸作用，将样本中的总胆红素氧化成胆绿素，由此测定钒酸作用前后的吸光度差，并与已知浓度的标准溶液比较，从而计算出样本中胆红素的浓度[10]。

本次实验分别用重氮盐法和钒酸盐法对血清总胆红素进行了准确度实验和精密度实验。

准确度实验结果显示，两个浓度水平的样本测量中，重氮盐法测定结果与样本靶值的相对偏差均大于10%，但是小于15%，钒酸盐法测定结果与样本靶值的相对偏差均小于5%，说明钒酸盐法的准确度高于重氮盐法，能更好地适用于临床使用。精密度实验结果显示，两种方法测定结果的变异系数均小于10%;两个浓度水平的样本测量中，重氮盐法的变异系数均小于钒酸盐法;两个浓度水平的样本测量结果进行比较，高浓度样本的变异系数均小于低浓度样本。说明两种方法的精密度良好，均能满足临床试验的要求，重氮盐法的精密度高于钒酸盐法，高浓度样本的精密度高于低浓度样本。

重氮盐法在测定临床样本时，受到的干扰因素较多，如溶血、脂血、黄疸等因素对测定结果影响大[11]，因此临床使用范围较窄。钒酸盐法不受样本溶血、脂血因素的影响，因此临床使用范围广，且测定结果更能反映真实的浓度。重氮盐法试剂长期稳定性较差，已知北京九强生物技术股份有限公司生产的两种试剂盒均使用叠氮钠作为防腐剂，而叠氮钠可能破坏偶氮试剂，从而影响重氮反应[12]，使实验结果数据偏离真实值。钒酸盐法的试剂更稳定，且双试剂可直接使用，操作简单，适合临床上全自动生化分析仪的操作。北京九强生物技术股份有限公司生产的两种试剂盒，重氮盐法的线性区间为3.0～513.0 ?mol/L，钒酸盐法的线性区间为3.0～684.0 ?mol/L，可知钒酸盐法的线性范围更广，临床适用范围广泛。

4 结语

肝脏是人体重要的器官，参与人体多种物质的代谢，包括三大营养物质的代谢，同时肝脏是人体最重要的解毒器官，内源性和外源性毒物均需要在肝脏代谢转化成无毒物质后排泄。如果肝脏出现问题，肝脏所参与的各种物质的代谢过程均可能出现紊乱，从而对人体健康产生危害，甚至危及生命。临床对肝功能评价包括多种指标，主要是血清生化检测指标，其中检测胆红素水平可反映肝脏对胆红素代谢的能力。人体内胆红素有两种存在形式，即直接胆红素和间接胆红素，二者之和为总胆红素。肝脏是胆红素的主要代谢场所，包括肝细胞对胆红素的摄取、转运和排泄等一系列的过程。当肝功能受损时，肝脏对胆红素的代谢能力下降，血清中胆红素水平升高。临床对胆红素测定有多种方法，其中重氮盐法是最早被发现使用的，但是其受溶血等影响较大，线性范围较窄，且试剂稳定性较差，临床使用具有一定的局限性。随着技术的发展，多种胆红素检测方法被发现，其中钒酸盐氧化法因具有多种的优越性而被普遍接受。本文对重氮盐法和钒酸盐氧化法检测血清总胆红素进行比较，实验结果发现两种方法均具有较好的重复性和准确性，其中钒酸盐氧化法的准确度高于重氮盐法。

参考文献

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