7个品种草莓茎尖组培脱毒苗技术研究

沈 莉，曹玉梅

(互助县现代农业示范园区管委会，青海 互助 810599)

草莓作为一种深受消费者喜爱的鲜果，其营养价值高，富含维生素C，有帮助消化的功能。国家统计局数据显示，截至2019年我国草莓种植面积为1.25×105hm2，同比增长4.17%；草莓产量达3.28×106t，同比增长7.05%。其中山东、江苏、辽宁三省在我国草莓产量中的占比近半，为48%，是我国草莓主产区[1]。

近年来互助县草莓鲜果种植面积逐年增加，草莓鲜果平均公顷产量达16.5t，纯收入75万元/hm2以上，全县草莓鲜果产量310t，产值900万元以上[2]。但是，青海互助地区种草莓种植年限较短，草莓作为一个新兴产业还未形成完整产业链，种苗的来源与草莓病毒病制约着产业发展，在已报道的草莓病毒中，危害最为严重的病毒有草莓镶脉病毒(SVBV)、草莓斑驳病毒(SMOV)、草莓皱缩病毒(SCV)、草莓轻型黄边病毒(SMYEV)4种[3]。要想解决这个问题，自主培育草莓脱毒苗是最有效的途径，前人提出草莓茎尖组织培养技术是草莓脱除病毒的一种最经济有效的途径[4]。本试验为高寒地区利用茎尖组织培养培育草莓脱毒苗提供了参考依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

根据2018—2019年互助县农业示范园区引进草莓新品种在互助县威远镇、塘川镇、台子乡等地的试种结果，选择其中生长性状良好、鲜果口感佳的“白雪公主”、“章姬”、“红颜”、“甜查理”、“通州公主”、“小白”和“京泉香”7个草莓品种。于2019年6月-7月采集匍匐茎用于茎尖组培。

1.2 试验方法

1.2.1 试验材料的采集

匍匐茎长出一周后即可采集，此时生长点明显易辨别。选择生长健壮无病虫害侵染的草莓匍匐茎，用灭菌剪刀剪取前端3-5cm长的茎段，置于无菌瓶中，即刻带回实验室，用自来水持续冲淋30min以上。冲淋时瓶口包裹2层干净纱布，用皮筋扎好瓶口，避免茎段溢出。

1.2.2 试验材料的灭菌处理

将瓶装75%酒精、3%次氯酸钠溶液、3%双氧水及瓶装茎段用75%酒精喷雾消毒后放入超净工作台，进行茎段灭菌。灭菌顺序及时间为：75%酒精，30s-3% NaClO，1.5min-3% H2O2，10s-灭菌纯水清洗3至4遍。经试验证明污染率控制在2%以内，实际操作过程中清洗时间长短可视茎段幼嫩程度适当增减。

1.2.3 茎尖诱导培养基的选择

将电子显微镜下剥出的大小约为0.1-0.5mm的茎尖全部接种到MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L GA3的试管装培养基中，pH=5.8-6.0，每升培养基添加30g蔗糖和7g琼脂，121℃灭菌30min；配方根据前人试验结果适当调整[5]，每管培养基接种1个，避免相互污染。置于温度(25±2)℃，光照强度2000-3000 lx，光照时长12-16 h/d，湿度45%-50%的条件下培养，每个品种至少接种50个，接种30d后观察各品种茎尖成活分化情况。

注：若操作不当，试管一般在进入培养室后3-7d出现污染，要及时移出培养室并进行灭菌处理，减少污染源传播。茎尖剥离过程中有可能会将叶原基误当做茎尖生长点，在接种一周左右即能观察到叶片展开却无其他组织分化，及时剔除即可。

1.2.4 芽丛继代

茎尖生长约50-60d后，发育良好的会长出密集芽丛，待芽丛长至3-5cm进行继代，在灭菌牛皮纸或培养皿上用解剖刀切开芽丛，接种到与茎尖诱导一样的培养基中，3-5丛/瓶。置于适宜条件下(一般与茎尖培养条件一致)培养2个月左右，按需要生根或二次继代。一般继代次数不超过5次，否则幼苗生长弱化。

1.2.5 生根培养

对各品种组培苗按比例进行病毒抽检，一般为5%，抽检合格后准备生根。将组培苗在超净工作台中转入生根培养基，本试验中选择MS+0.2mg/L IBA，pH=5.8-6.0，每升培养基添加30g蔗糖和7g琼脂；参考前人方法略有调整[6]。在培养室培养1个月左右(环境条件与前期一样)，观察各品种幼苗根部生长情况。

1.2.6 幼苗的炼苗与移栽

将幼苗连带培养瓶全部转移至提前消毒灭菌过的温室中，前3d遮阴、少通风，之后每日增加光照时长，逐渐打开培养瓶盖，使幼苗逐步适应温室环境。炼苗约7-10d后，完全打开瓶盖，用清水冲洗干净幼苗根部培养基，移栽到32孔穴盘中，穴盘基质为不加任何底肥的草莓专用基质。进行正常水肥管理，观察各品种生长情况。

1.2.7 早期开花结果试验

穴盘移栽1-2月后，幼苗根部发育健壮。挑选植株生长正常、根系发达的健康母株，移栽到花盆中，进行正常管理并观察记录开花、结果等性状，从中挑选结果性状优良的原原种苗并标记，后续可繁殖原种苗和生产苗。

1.3 数据分析

试验数据采用Excel 2007以及SPSS 17.0软件进行统计分析。各数据指标如下：成活率(%)=(成活茎尖数/接种茎尖总数)×100%；生根率(%)=(生根幼苗数/接种幼苗总数)×100%；移栽成活率(%)=(移栽幼苗成活数/移栽幼苗总数)×100%。

2 结果与分析

2.1 同一诱导培养基配方对不同草莓品种茎尖分化的影响

生长30d左右统计茎尖分化情况，从表1可以看出：MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L GA3培养基适合“红颜”、“甜查理”、“通州公主”和“小白”4个草莓品种茎尖生长，成活率超过80%，但不适合“京泉香”、“章姬”、“白雪公主”生长。后期还需要对生长不良3个草莓品种茎尖适宜生长培养基配方进行细致研究。

表1 同一培养基对不同品种草莓茎尖诱导分化的影响

2.2 同一培养基配方对不同草莓品种幼苗增殖的影响

茎尖生长40d左右达到增殖标准，经过外送病毒检测后，无病毒的植株选用与接种培养基一样的配方增殖，其中“白雪公主”茎尖数量少，长势很差，放弃增殖。幼苗增殖后置于与茎尖培养相同条件下培养，20d左右观察幼苗生长情况。从表2可以看出，剩余6个品种草莓中，除甜查理外增殖系数均在7以上，幼苗生长正常。

表2 草莓幼苗增殖情况统计表

2.3 同一培养基配方对不同草莓品种幼苗生根的影响

增殖30d左右，开始生根培养。采用MS+0.25mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L卡拉胶的瓶装培养基，参考前人方法略有调整[6]；每瓶接种5株，培养条件与增殖期相同，生根15d左右，观察各品种生根情况。从表3可以看出，初期各品种植株生长正常，生根速度较快。培养20d左右，幼苗根部出现黑褐色瘤状物，根部生长异常。生根培养基配方还需进一步调整和试验。

表3 草莓幼苗生根情况统计

2.4 幼苗炼苗与移栽

生根30d后应准备炼苗移栽，本试验中由于移栽场地限制，幼苗生根培养后一直在组培室培养2个月。2021年5月1日-5月5日连带培养瓶转移到园区连栋温室进行炼苗，前3d采取遮阴措施，室内温度保持在22℃左右。2021年5月6日全部移栽到32孔穴盘中，穴盘基质为无底肥草莓专用基质，移栽后进行正常管理。其中，京泉香株数过少，补做后续结果试验。从表4可以看出，不添加底肥的草莓专用基质适合幼苗的生长，成活率均在96%以上。

表4 幼苗移栽后成活率

2.5 幼苗花芽分化检测

移栽约2个月后，待幼苗根系发达、植株生长良好时，抽样检测花芽分化情况，每个品种随机取样10株，带回实验室在电子显微镜下观察是否有花芽。从表5可以看出，各品种幼苗花芽分化比例差异较大，同一取样时间下，“甜查理”、“小白”、“通州公主”花芽分化比例较高，“章姬”花芽分化比例最小。

表5 草莓幼苗花芽分化情况统计表

2.6 开花结果研究

花芽分化检测完成，将穴盘苗移栽到花盆中进行开花结果试验。每盆种植一株，避免根部病害的相互传染，并且有利于优势植株的选择与标记。原原种苗种植后，连续观察各品种开花、结果情况，具体定植和开花时间见表6，可以看出原原种苗种植后，陆续开花结果，畸形果很少、果实口感佳，植株生长正常。

表6 原原种苗开花时间统计表

3 结论与讨论

试验结果表明，在同一茎尖诱导培养基中，不同品种草莓茎尖成活情况差异较大，MS添加0.5mg/L6-BA和0.2mg/LGA3适合“红颜”、“甜查理”、“通州公主”和“小白”茎尖诱导，说明浓度适宜的6-BA和GA3可促进草莓茎尖的诱导分化，前人对“红颜”草莓的茎尖组培研究结果也表明：6-BA主要影响草莓的茎尖增殖，KT、GA3和活性炭影响其生长[7]；但是“京泉香”、“章姬”和“白雪公主”茎尖分化率低，说明不同草莓品种茎尖分化所需生长调节剂种类和浓度不同。前人试验结果指出培养基MS+0.5mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA适宜“红颜”、“章姬”草莓茎尖分化[8]；MS+0.5mg/L 6-BA适宜“甜查理”草莓茎尖诱导[9]。

剥离的茎尖大小也可能影响到茎尖的诱导成活情况，前人试验证明：接种0.3-1.0mm的草莓茎尖都可以诱导出苗，但是茎尖的大小对草莓组培苗的成活率和脱毒率影响比较大，当茎尖小于0.5mm时，诱导绿色植株的时间比较长，需要30d，脱毒率可以达到80.0%，但是成活率仅有33.3%。当茎尖大小在0.5-0.8mm时，成活率和脱毒率分别为63.3%和68.4%[10]。本试验中，白雪公主茎尖存活率低可能与剥离茎尖过小和培养基配方不适宜两个原因均有关系。

在试验中发现，MS添加0.25mg/L IBA有利于草莓组培幼苗的快速生根，但是培养时间超过20d根部异常，说明该培养基不适宜幼苗的长期生长，而前人试验采用1/2 MS添加0.1或0.3mg/L IBA，“红颜”草莓根系较长且粗壮[11]，这说明在组培苗生根阶段培养基中过多的基本元素可能会影响根部的正常生长。

在幼苗生根培养阶段发现，大多数幼苗在培育30d左右会出现叶片发黄的症状，适当调整组培室温度到18℃左右，叶片全部转绿，恢复正常生长。说明草莓组培苗在培养后期需要保持较低的环境温度，温度过高容易使幼苗失水发黄。