具有吸附功能的再生丝素蛋白复合膜的制备

王津津 李慧慧 郭建军 蒋蕾 李航 武国华

摘要：本文以埃洛石纳米管（HNTs）对再生丝素蛋白（RSF）进行共混改性，采用流延法制备了一种新型的生物吸附剂HNTs/RSF复合膜。表征结果表明，25% HNTs/RSF复合膜具有良好的机械性能和热稳定性，其中25% HNTs/RSF复合膜的断裂强度和断裂伸长率分别达到（6.67±0.65） MPa和291.17%±16.74%，相比RSF膜分别提高了84.3%和278.2%。通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）和广角X射线衍射（WAXD）分析表明，HNTs降低了RSF膜的β折叠和结晶度。进一步通过亚甲基蓝的吸附实验表明，增加环境的碱性或HNTs含量，均有助于提高其吸附性能，在300 min后基本达到吸附平衡。本文基于此制备了具有高吸附性能和优异机械性能的HNTs/RSF复合膜，在医药化工废水处理和生物吸附等领域具有较高的开发和利用价值。

关键词：再生丝素蛋白;埃洛石纳米管;共混改性;力学性能;亚甲基蓝;吸附

中图分类号：TS102.54文献标志码：A文章编号： 10017003（2022）06003410

引用页码： 061105

DOI： 10.3969/j.issn.1001-7003.2022.06.005（篇序）

基金项目： 江苏省特聘教授专项基金项目（苏教师〔2015〕17号）;国家特种农产品质量安全风险评价项目（GPFP1801003）

作者简介：王津津（1997），女，硕士研究生，研究方向为生物材料。通信作者：武国华，研究员，ghwu@just.edu.cn。

印染废水是一种水质成分复杂、色度高的有机废水，因其毒性强、难降解、排放到环境中容易被生物体积蓄、会长期滞留等多种特点成为长期以来医药化工废水治理中备受关注的难题^[1]。印染废水的处理方法通常为混凝沉淀法^[2]、生物反應器法^[3]、光催化法^[4]、吸附法^[5]。其中，吸附法具有效率高、对环境影响小、应用范围广、操作简单、易收集再利用等优点。吸附法的原理是依靠分子间的引力或化学键之间的作用力，使染料分子能有效地固定在吸附剂表面，从而达到净化水体的目的^[6]。

埃洛石纳米管（Halloysite nanotubes，HNTs）是一种在自然界广泛存在的低成本天然材料，具有高比表面积和特殊管状结构。其管状结构由带负电荷的SiO₂外表面和带正电荷的Al（OH）₃内表面组成^[7]。另外，其表面大量的羟基有助于HNTs在不同溶剂中更好地分散。因此，HNTs被用于染料吸附、重金属吸附、药物传递、膜过滤和表面功能化等众多领域^[8-9]。然而，仅HNTs单一材料，难以在水处理中广泛应用，因为吸附后的HNTs粉末不易回收，且需要经历漫长和复杂的再处理过程。寻找合适的HNTs应用载体，形成可定向且规模使用的宏观固体纳米吸附复合材料成了一项重要而有意义的工作。

近年来，再生丝素蛋白（Regenerated silk fibroin，RSF），是一种从蚕茧中提取的再生动物蛋白，也可以从大量废弃丝织品中获得^[10]。因它具有优异的力学性能、可降解性和生物相容性及环境友好，而被广泛应用于服装、医疗、化妆品等行业，并逐渐受到国内外科研人员的关注，根据用途将RSF加工成纤维^[13]、薄膜^[14]、海绵^[15]或微球^[16]等各种材料。此外，再生丝素蛋白具有亲水性和两性特性，已被证明可以有效地与各种有机或无机污染物^[17-18]相互作用，并通过与各种有机或无机填料的结合进一步提高其性能，成为医药化工废水处理的潜在生物吸附载体。研究发现，环境pH值、温度、有机溶剂等^[19]对RSF中晶体和β折叠结构有很大的影响，可以通过调节制备工艺条件，从而获得一种水稳定的材料，在与水污染物相互作用中保持较为稳定的结构构象，从而延长使用寿命。

综上，本文以再生丝素蛋白为固体基质，通过埃洛石纳米管的共混改性，采用流延法制备了一种具有高吸附性能和良好机械性能的HNTs/RSF天然复合膜材料。同时，利用不同的表征方法探索HNTs对再生丝素蛋白膜内部结构的影响，充分挖掘可再生的丝素蛋白在生物吸附和污染物处理等领域的二次开发和潜在利用价值。

1 实 验

1.1 试剂、材料与仪器

甲酸、碳酸钠、无水氯化钙、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司），蚕茧（中国农业科学院蚕业研究所），纳米埃洛石（上海阿拉丁有限公司）。

DF-101S磁力搅拌器（巩义予华仪器有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（上海荣丰科学仪器有限公司），UV775B紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），Thermo Scientific Nicolet iS10傅里叶变换红外光谱仪（美国赛默飞世尔公司），S-4800场发射扫描电子显微镜（日本日立公司），Pyris 1 TGA热重分析仪（美国珀金埃尔默公司），Xeuss2.0 X射线散射仪（法国Xenocs公司），Instron-5967万能材料试验机（美国Instron公司）。B7CF044E-29E3-4739-8D56-0F70DB4106D8

1.2 过 程

1.2.1 RSF溶液的制备

称取一定量的蚕茧，将其剪成指甲盖大小的片状，放入0.05% Na₂CO₃水溶液中，煮沸30 min进行脱胶处理后用去离子水反复漂洗3次去除杂质，上述过程循环3次。最后将完全脱胶后的丝素置于45 ℃下烘干至恒重，存入塑封袋中备用。

1.2.2 HNTs/RSF复合膜的制备

制备方法根据文献[17]，制备流程如图1所示。分别加入不同质量的HNTs于5% CaCl₂-FA溶液中，室温下搅拌1 h。之后加入一定量的丝素使其充分溶解，室温下搅拌4 h，然后将HNTs均匀分散到上述丝素溶液中，使最终HNTs相对丝素质量分数为5%、10%、15%、20%、25%。将共混液倒入水平的乙烯基模具（直径60 mm）上浇铸薄膜;放入通风橱待甲酸挥发48 h后，将半成品在凝固浴乙醇中浸泡2 h，以去除CaCl₂和残留的甲酸;最后将HNTs/RSF复合膜剥去，自然风干。

1.2.3 力学性能测试

对添加了不同质量浓度HNTs的RSF膜进行分析，而在测试前破裂或从钳夹中滑出的样品被排除在进一步的评估之外。将膜切成50 mm×10 mm的均匀条状（每个样品n=5），夹具长度和初始速度分别预设为20 mm和20 mm/min进行力学性能测试。

1.2.4 溶胀率和溶失率测定

采用称重法测量RSF膜和质量分数为25%-HNTs/RSF复合膜的溶胀率和溶失率。将复合膜在105℃烘箱中烘干后，称取一定质量的样品（W₀），分别置于相同体积的不同pH值溶液中（3、7、11）浸泡24 h，在37 ℃下恒温振荡24 h，用滤纸快速吸干表面水分后称重（W₁），最后置于105 ℃烘箱中烘干称重（W₂）。溶胀率（SWR）和溶失率（WSR）计算公式如下：

SWR/%=W₁-W₀W₀×100    （1）

WSR/%=W₀-W₂W₀×100    （2）

1.2.5 吸附性能测定

选取亚甲基蓝染料测试HNTs/RSF复合膜的吸附性能，该实验在24 ℃下进行，准确称取一定量的样品，浸泡在100 mL（40 mg/L）亚甲基蓝溶液中，考察pH值、HNTs添加量、接触时间对染料去除率的影响。亚甲基蓝吸附量和去除率的计算公式如下：

q_e=V（c₀-c₁）m    （3）

R/%=c₀-c₁c₀×100    （4）

式中：q_e为平衡吸附量，mg/g;V为亚甲基蓝水溶液体积，mL;c₀和c₁分别为吸附前初始质量浓度和吸附平衡后的质量浓度，mg/L;m为HNTs/RSF复合膜的投加量，g;R为亚甲基蓝去除率，%。

亚甲基蓝浓度采用分光光度法测定（最大吸收波长668 nm），标准曲线为y=0.096 2x-0.006 4，R2=0.99;pH值采用PHS-3C型精密pH值计测定。

1.2.6 数据分析

所得数据用Origin 2017软件作图，结果表示为三个平行实验的平均值±标准差。显著性检验用SPSS 23.0分析处理，Duncan多重比较分析，图表中不同字母表示差异显著，p<0.05。

2 结果与分析

2.1 HNTs/RSF复合膜的形貌分析

图2为HNTs的扫描电镜和动态散射（DLS），结果证实HNTs呈管状形，分布均匀，尺寸为（242.4±34.38） nm。利用扫描电镜（SEM）分別对RSF膜和HNTs/RSF复合膜的微观结构进行表征，如图3所示。相比RSF膜（图3（a）），HNTs/RSF复合膜（图3（b））表面较为粗糙，有少量孔洞且可以明显观察到纳米颗粒的存在。图3显示，RSF膜的截面（图3（c））形成光滑致密且规则的褶皱形状，而HNTs/RSF复合膜截面（图3（d））由于纳米颗粒的存在，形成了大量的孔洞和裂纹，同时在这种结构中能够明显地观察到分布均匀的HNTs，这种疏松多孔结构可能会增加一定的表面积，有利于染料等物质的吸附。

2.2 HNTs/RSF复合膜的红外分析

图4为RSF膜和HNTs/RSF复合膜的红外光谱。由图4可见，1 650 cm^-1和1 620 cm^-1（酰胺I）处，1 230 cm^-1和1 265 cm^-1（酰胺Ⅲ）处显示出丝素蛋白的特征吸收峰^[20]均存在，说明HNTs并未改变丝素蛋白本身的结构。由于FTIR测试是在开放的环境中进行的，空气中的水分子会干扰酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ区域，但酰胺Ⅲ区域不受水分子的影响。因此，在本文中，酰胺Ⅲ区（1 200～1 300 cm^-1）被用来半定量研究每个样品的蛋白质构象转变。其中，1 230 cm^-1和1 265 cm^-1处的峰分别是α螺旋/无规则卷曲和β折叠的吸收。如图5所示，RSF和HNTs/RSF复合膜中α螺旋/无规卷曲和β折叠的含量可以看出，HNTs的存在导致β折叠含量明显降低，其中RSF膜的β折叠含量为45.93%±0.38%，当HNTs含量为25%时，β折叠含量最低，达到35.82%±0.80%。这说明HNTs的加入阻碍了α螺旋/无规卷曲向β折叠的转变，或不利于β折叠的形成，可能是由于HNTs的存在导致丝素分子的结构重排，从而影响丝素蛋白的聚集。B7CF044E-29E3-4739-8D56-0F70DB4106D8

2.3 HNTs/RSF复合膜的广角X射线衍射（WAXD）分析

本文进一步采用WAXD分析HNTs对RSF复合膜结构的影响，如图6所示。2D-WAXD图明显显示，25%-HNTs/RSF復合膜的衍射环同时具备RSF和HNTs的特征衍射环。使用Fit2D对2D-WAXD进行积分，得到一维衍射角曲线，并用peakfit进行分峰拟合。如图7所示，RSF膜显示在2θ=8.68°、17.06°、20.81°、24.14°、26.75°和30.53°出现结晶衍射峰，其符合silk Ⅱ的β片层结构^[21]。与RSF膜相比，HNTs复合膜中显示出4个新的衍射峰，为HNTs的特征峰，其中2θ=12.5°、20.0°、25.6°、27.1°。同时，从表1可以看出，HNTs/RSF复合膜的结晶度明显下降，这与之前β折叠含量变化趋势一致。这可能是由于HNTs的存在导致周围的RSF分子运动受限，结晶度下降。利用Scherrer公式^[22]计算晶粒尺寸，（210）（200）和（002）三个晶面分别对应晶粒尺寸在a（链间）、b（片层间）和c（纤维轴）方向的大小。结果显示，由于HNTs的存在，RSF的晶粒体积增大。在RSF分子形成膜的自组装过程中，HNTs与RSF分子产生相互作用，导致RSF分子运动受限难以形成晶粒。同时，由于纳米颗粒的物理吸附作用，形成的小晶粒容易团聚成尺寸更大的晶粒，所以在HNTs/RSF复合膜中形成晶粒少而大的晶体结构^[23]。

2.4 HNTs/RSF复合膜的热稳定性分析

膜的热稳定性是其实际应用的一个重要指标。如图8所示，本文对RSF和25%-HNTs/RSF复合膜进行热重分析，得到TGA和DTG曲线。结果显示，RSF膜和25%-HNTs/RSF复合膜随着温度的上升重量损失过程基本相同，且二者均含有20%左右的水分，在热处理中这些水分很快就被除去。DTG曲线显示，RSF膜和HNTs/RSF复合膜降解峰分别出现在243.9 ℃和251.5 ℃，所对应的失重率为68.87%和67.33%。与RSF膜相比，HNTs/RSF复合膜失重速率较为缓慢，其热稳定性有所提高，使其具有开发和应用价值的潜力。

2.5 HNTs/RSF复合膜的力学性能分析

图9为不同质量分数的HNTs/RSF复合膜的力学性能测试结果。由图9可知，当HNTs质量分数为25%时断裂强度和断裂伸长率最高，分别为（6.67±0.65） MPa和291.17%±16.74%。同时，相对于RSF空白膜的断裂强度和断裂伸长率仅为（3.62±0.31） MPa和76.88%±10.44%（表2），分别提高了84.3%和278.2%。与RSF相比，HNTs质量分数少（≤15%）的RSF复合膜在断裂强度方面无明显差异，但是其断裂伸长率有所提高，表现出更好的柔韧性。与Kopp等^[24]报道并制备的丝素膜断裂强度1.4 MPa、断裂伸长率30%相比，本文制备的HNTs/RSF复合膜力学性能良好。说明HNTs的添加对丝素蛋白膜的力学性能有积极影响，可有效促进RSF膜的韧性和刚性。结合FTIR和WAXD结果，推测HNTs的存在阻碍了RSF中无规卷曲和α螺旋构象向β折叠构象的转变，导致RSF复合膜的结晶度下降，说明无定型区域的增加是断裂伸长率上升的主要原因。这与Pan等^[25]提出的纳米受限结晶增韧机制相符合，HNTs在RSF基质中充当一个交联节点，与RSF晶粒连接形成交联网络，使再生丝素复合膜的韧性大幅增加。优良的机械性能是膜材料在众多领域应用的前提，同时作为吸附剂其优异的韧性也可以在存储和吸附过程中提供更多的实用和便捷。

2.6 HNTs/RSF复合膜的溶胀率与溶失率

图10是RSF膜和25%-HNTs/RSF复合膜在不同pH值溶液中浸泡24 h后的溶胀率和溶失率。由图10（a）可以看出，当溶液pH值由3变为9的时候，RSF膜的溶胀率由25.4%±3.6%升至59.8%±7.2%，而HNTs/RSF复合膜的溶胀率随pH值的变化较为稳定，且在中性和碱性环境中都比RSF膜的溶胀率低。另由图10（b）可以看出，在不同的pH值环境下，HNTs/RSF复合膜的溶失率与RSF膜相比均有显著性的降低。在水溶液中纯丝素大分子之间的氢键易被水与丝素大分子形成的氢键取代^[26]，推测是由于HNTs表面的羟基与丝素分子中的羧基和氨基形成分子间氢键，提高了复合膜在水中的稳定性，从而使丝素蛋白分子溶胀性能和溶失性能降低。说明与RSF膜相比，HNTs/RSF复合膜的溶胀率与溶失率随pH值的波动较为平缓。

2.7 HNTs/RSF复合膜对亚甲基蓝的吸附性能

本文选取亚甲基蓝染料模拟测试HNTs/RSF复合膜的吸附性能。如图11（a）所示，不同pH值环境下，25%-HNTs/RSF复合膜对亚甲基蓝吸附能力的影响。随着pH值的增加，样品对亚甲基蓝的吸附率逐渐上升，从56.18%上升至94.74%，说明碱性环境更利于HNTs/RSF复合膜对亚甲基蓝的吸附。其中pH 10时该复合膜对亚甲基蓝的去除率为94.74%±1.09%，吸附容量为（12.63±0.15） mg/g，为吸附最佳条件。此外，比较不同HNTs质量分数对RSF复合膜对亚甲基蓝的吸附效果。结果表明，纳米颗粒质量分数为25%和30%时对染料的吸附率分别为95.05%±0.56%、95.99%±0.56%，而RSF膜去除率仅为57.04%±1.68%，分别提高了66.63%和68.3%（图11（b））。说明HNTs的加入提高了RSF膜对亚甲基蓝的吸附性能。B7CF044E-29E3-4739-8D56-0F70DB4106D8

在pH 10的條件下，进一步考察随接触时间变化，25%-HNTs/RSF复合膜对亚甲基蓝的吸附效果，如图12所示。结果显示，HNTs/RSF复合膜对亚甲基蓝的吸附过程表现为吸附位点较多的初始阶段，染料分子向样品表面扩散，通过理化特性被快速负载，到60 min后吸附能力下降，进入平衡前的一个缓慢吸附过程，最终在300 min达到吸附平衡。

2.8 吸附等温线

吸附等温线模型用于描述恒温下吸附质和吸附剂之间的关系。本文选用两种常用的等温线模型Langumir和Freundlich来分析HNTs/RSF复合膜对亚甲基蓝的吸附，实验结果如图13所示。

Langumir等温吸附模型用于表征单分子层吸附过程，计算公式如下：

C_eq_e=1q_mb+C_eq_m（5）

式中：C_e是染料溶液的平衡浓度，mg/L;q_e是染料的平衡吸附量，mg/g;q_m是对应于完整单层覆盖的最大吸附容量，mg/g;b（L/mg）是Langumir常数，与结合位点的亲和力有关。

Freundlich模型多用于非均相的多分子层吸附，计算公式如下：

lnq_e=lnK_f+1nlnC_e（6）

式中：K_f为Freundlich吸附系数;1/n为Freundlich常数反映吸附过程的吸附强度，一般认为1/n小于1易于吸附。

表3总结了拟合的Langumir和Freundlich模型参数。对于亚甲基蓝染料模型，Langmir等温线模型的R2值高于Freundlich模型，表明亚甲基蓝染料分子在HNTs/RSF复合膜上的吸附遵循Langmuir的单层表面覆盖模型。证实本文制备的HNTs/RSF复合膜是一种结构均一的吸附剂，对亚甲基蓝的最大吸附量为27.88 mg/g。表4列出了从相关文献中收集的其他吸收剂对亚甲基蓝的吸附程度，以及本文研究的结果。结果表明，HNTs/RSF复合膜具有相当的吸附能力，可以作为一种有效的吸附剂用于废水中染料的去除。

3 结 论

本文采用流延法制备了一种基于可再生丝素蛋白，可控且高效的HNTs/RSF新型复合生物吸附膜。HNTs的加入可有效提高RSF膜的韧性和刚性，当质量分数为25%时，断裂强度和断裂伸长率均为最高，分别为（6.67±0.65） MPa和291.17%±16.74%。FTIR和WAXD分析表明，一定量的HNTs可有效降低丝素膜中β折叠的含量，有利于RSF分子形成晶粒少而大的晶体结构，这可能是导致HNTs/RSF复合膜机械性能提升的原因。吸附结果显示，调控溶液的pH值或RSF膜中HNTs的质量分数，均有助于提供更多吸附位点，提高对亚甲基蓝的吸附性能，在300 min后基本达到吸附平衡。SEM结果表明，HNTs的加入导致膜表面趋于粗糙，内部呈现疏松多孔结构。这种疏松多孔结构是HNTs/RSF复合膜具有优异吸附性能的原因之一，同时HNTs/RSF复合膜具有良好的热稳定性。因此，HNTs/RSF复合膜可作为一种可控且高效的生物吸附剂去除废水中的染料，这种新型的可持续生物吸附剂在实际应用中具有潜在的应用价值。

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Preparation of regenerated silk fibroin protein composite films with adsorption function

WANG Jinjin^1a， LI Huihui^1b， GUO Jianjun^1a，2， JIANG Lei^1b， LI Hang^1a， WU Guohua^1a，b

（1a.College of Biotechnology; 1b.College of Environmental and Chemical Engineering， Jiangsu University of Science and Technology，Zhenjiang 212100， China; 2.College of Agriculture， Anshun University， Anshun 561000， China）

Abstract：Dye wastewater is becoming a serious environmental problem due to its toxicity， unacceptable color， high chemical oxygen demand， and resistance to chemical， photochemical and biological degradation. The release of organic dyes into water systems takes the form of pharmaceutical and chemical wastewater， agricultural runoff， and chemical spills. In order to achieve sustainable development， the research， development， and application of degradable natural polymeric materials-silk proteins， have attracted a lot of attention from researchers in terms of adsorbent substrate materials. China is a large producer and processor of silk， accounting for 65% of the global production of raw silk. During the production and processing of silk， a large amount of trimmings are produced. However， the current unmodified pure silk fibroin protein film has disadvantages such as poor mechanical properties， high water solubility， and instability. Regenerated silk fibroin protein （RSF） is a protein obtained from silkworm cocoons through degumming， dissolving， and dialysis. At the same time， it can be processed into the form of fibers， films， gels， microspheres， etc. Halloysite nanotubes （HNTs） have the advantages of toughness， low cost， high specific surface area， good biocompatibility， and environmental friendliness. It is widely used in cosmetics， drug slow-release， water treatment， and other fields. In this study， RSF was modified by the addition of HNTs to prepare HNTs/RSF composite films with high adsorption and excellent mechanical properties as a potential biosorbent carrier for dye wastewater treatment.B7CF044E-29E3-4739-8D56-0F70DB4106D8

In this paper， a series of HNTs/RSF composite films were prepared by the coasting method by blending HNTs with RSF solution at mass fractions of 5%， 10%， 15%， 20%， 25%， and 30%， respectively. The effects of different mass fractions of HNTs on the microscopic morphology， secondary structure， crystal structure， thermal stability， and mechanical properties of the RSF films were investigated. With the elongation at the break of the composite membrane as a reference index， the 25%-HNTs/RSF composite film was selected for testing the adsorption performance of methylene blue. This included tests on the effect of HNTs content， pH of the aqueous solution， and contact time on its adsorption performance. The use of HNTs/RSF film for the removal of dye from wastewater， besides being an interesting solution for the disposal of waste silk by the textile industry， also results in environmental， social， and economic benefits. It is found that the addition of HNTs is effective in overcoming the shortcomings of RSF films， such as rigidity and brittleness， as well as water solubility. Scanning electron microscopy （SEM） shows that the addition of HNTs results in a rough surface of the membrane and a loose porous structure inside. The mechanical properties results show that the addition of HNTs can significantly improve the toughness and rigidity of the RSF film. When the content of HNTs is 25%， the breaking strength and elongation at the break of the composite film reach the highest of （6.67±0.65） MPa and 291.17%±16.74%， which are 84.3% and 278.2% higher than those of the RSF film， respectively. Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR） and wide-angle X-ray diffraction （WAXD） analysis show that an appropriate amount of HNTs could effectively reduce the content and crystallinity of β-sheets in silk fibroin membranes， which may be the reason for the improved mechanical properties of HNTs/RSF composite membranes. The adsorption experiments of methylene blue show that increasing alkaline or HNTs content of the solution environment could improve the adsorption performance， and the adsorption equilibrium is reached after 300 min.

RSF， a regenerative biological protein， can be obtained from a large number of discarded textiles. Based on this， this work provides a method to prepare multifunctional regenerated silk-based composite membranes with high tenacity and obtain regenerated composite membranes with adsorption properties. The research results can provide reference for basic research such as improving the mechanical properties of regenerated silk-based proteins， and also have high development and utilization value in the fields of pharmaceutical and chemical wastewater treatment and biosorption.

Key words：regenerated silk fibroin; halloysite nanotubes; blend modification; mechanical properties; methylene blue; adsorptionB7CF044E-29E3-4739-8D56-0F70DB4106D8