狂犬病冻干灭活疫苗澄清与浓缩工艺的建立

崔松奇，张文芳，刘兴刚，李 娥，饶潇君，张 娜，李晓静

(豪威生物科技有限公司，天津 301700)

0 引言

狂犬病是由狂犬病毒引起的一种人兽共患传染病，临床症状表现为恐水、恐光、狂躁不安等[1]。狂犬病毒可感染犬、猫、狐狸等温血动物，人一旦感染，致死率几乎100%[2]。据估计，狂犬病流行于全球150多个国家，每年造成约59 000人死亡，其中95%的病例发生在非洲和亚洲[3]，其中亚洲占56%，非洲占44%。大多数死亡(84%)都发生在农村地区，其主要原因是对于犬狂犬病监管力度不足，特别是农村从犬传染给人的事件时有发生[4]。我国狂犬病全年都有流行，但相对集中于夏秋季节，主要是农民、学生、散居儿童发病较多[5]。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)建议将犬类狂犬病疫苗接种率提高至70%[6]，能有效阻止狂犬病毒的传播。大规模犬类免疫接种也是消除人类狂犬病的根本措施[7]。因此探索狂犬病毒兽用疫苗制备工艺，研制安全高效价的兽用疫苗，从源头控制，以切断动物散毒途径，对控制人感染狂犬病病毒事件的发生具有重大意义。

1 材料

连续流离心机:GL-21M型，购自湘仪公司。

紫外分光光度计:BIOWAVE DNA，购自英国WPA公司。

10寸0.45 μm孔径聚醚砜材质滤芯及套筒:购自Millipore公司。

10寸6～40 μm和0.45～2 μm孔径的双级玻璃纤维材质滤芯及套筒:购自PALL公司。

狂犬病毒液:由本公司产车间提供。

实验动物:昆明系小鼠，11～13 g，购自北京实验动物中心。

中空纤维柱(500 k、750 k膜孔径)及切向流浓缩夹具:聚醚砜材质，0.5 m2膜面积，购自GE公司。

超滤膜堆(100 k、300 K膜孔径)及切向流浓缩夹具:Millipore公司，Pellicon2 盒式滤器，改良聚醚砜材料，0.5 m2膜面积膜堆。

检验用强毒狂犬病固定毒巴黎株:代号AV2011，代次，21代，规格 0.1 g，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。

狂犬病参考疫苗标准品:Rabies Vaccine(Inactivated)CRS，European Pharmacopoeia。

2 方法

2.1 澄清试验

1)利用连续流离心机，在13 000 r/min转速下，采取50 mL/min的进液量，对20 000 mL狂犬病毒液进行连续离心澄清。

2)使用10寸0.45 μm膜孔径聚醚砜材质滤芯对20 000 mL狂犬病毒液进行过滤澄清。

3)使用10寸6～40 μm和0.45～2 μm膜孔径的双级玻璃纤维材质滤芯对20 000 mL狂犬病毒液进行过滤澄清。

4)记录每种澄清方式的处理量以及澄清时间。

5)采集澄清前和澄清后病毒液样品进行病毒含量测定，采用小鼠脑内接种法测定LD50。

6)使用紫外分光光度计对澄清前和澄清后病毒液样品进行蛋白含量的测定。用紫外分光光度计检测样品在260 nm和280 nm波长下的吸收值，通过公式计算总蛋白含量。

2.2 浓缩试验

1)分别采用500 k、750 k膜孔径中空纤维和100 k、300 k膜孔径超滤膜堆对澄清的狂犬病毒液进行浓缩，浓缩至原体积的1/50，收集浓缩后病毒液。

2)采集浓缩前和浓缩后病毒液样品以及透过液进行病毒含量测定、蛋白含量测定。

3)采集浓缩前和浓缩后病毒液样品以及透过液，使用终浓度为1/4000的β-丙内酯灭活狂犬病毒，使用NIH(National Institutes of Health)法进行浓缩前样品、浓缩后样品、透过液的效力检测。

3 试验结果

3.1 澄清试验结果

3.1.1 澄清前后抗原病毒含量测定结果

澄清前后抗原病毒含量测定结果如表1所示。可以看出，玻璃纤维和聚醚砜材质滤芯澄清前后病毒含量差异不显著，而离心方式由于耗时太长澄清前后病毒含量下降显著。这表明玻璃纤维和聚醚砜材质滤芯对病毒蛋白具有低吸附率和低拦截率。

表1 病毒含量测定结果 单位：LD50/0.03 mL

3.1.2 澄清前后抗原蛋白含量测定结果

澄清前后抗原蛋白含量测定结果如表2所示。可以看出，3种澄清方式澄清前后蛋白含量差异不显著，这表明3种澄清方式均具有低蛋白拦截的特性。由于3种方式澄清液的澄清度差异也不显著，这表明在澄清度方面，这3种方式均能达到要求。

表2 蛋白含量测定结果 单位：μg/mL

3.1.3 各种澄清方式澄清时间比较

各种澄清方式澄清时间如表3所示。可以看出，这3种澄清方式只有玻璃纤维材质滤芯才能满足规模化生产的要求，而离心方式和聚醚砜材质滤芯过滤方式都存在耗时太长的缺点。

表3 澄清时间

综上所述，由于双级玻璃纤维材质滤芯蛋白吸附少、澄清效率高，建议选择双级玻璃纤维材质滤芯作为狂犬病灭活疫苗下游生产工艺的澄清设备。

3.2 超滤浓缩试验结果

3.2.1 浓缩前后病毒含量测定结果(小鼠脑内接种法)

浓缩前后病毒含量测定结果如表4所示。可以看出，500 k膜孔径中空纤维、750 k膜孔径中空纤维、100 k膜孔径膜堆浓缩后病毒含量比浓缩前提高了1.0个滴度，300 k膜孔径膜堆浓缩前后病毒含量无显著变化；从滤出液的检验可以看出，500 k膜孔径中空纤维、750 k膜孔径中空纤维、100 k膜孔径膜堆，这三种浓缩方式可以有效拦截病毒蛋白，300 k膜孔径膜堆不能有效拦截病毒蛋白。

表4 浓缩前后病毒含量测定 单位：LD50/0.03 mL

3.2.2 浓缩前后抗原效价测定结果

浓缩前后抗原效价测定结果如表5所示。可以看出，采用750 k膜孔径中空纤维浓缩后的抗原，其效价均要高于500 k膜孔径中空纤维和100 k膜孔径膜堆，表明750 k膜孔径中空纤维浓缩效率高，病毒损失少；300 k膜孔径膜堆滤出液和浓缩前样品效价相差不显著，说明300 k膜孔径膜堆不能有效拦截狂犬病毒蛋白。

表5 浓缩前后抗原效价测定 单位：IU

3.2.3 各种浓缩方式杂蛋白去除效果比较

各种浓缩方式杂蛋白去除效果比较如表6所示。可以看出，500 K和750 K膜孔径中空纤维切向流超滤杂蛋白去除率优于100 K膜包切向流超滤约10%；300 K膜包由于不能有效截留病毒蛋白，所以浓缩后的蛋白含量要远远低于其他三组。

表6 杂蛋白去除效果比较

综上所述，由于750 K膜孔径中空纤维能够完全截留狂犬病毒蛋白，浓缩效率高、病毒损失少、杂蛋白去除效果好，建议选择750 k膜孔径的中空纤维作为狂犬病灭活疫苗下游生产工艺的浓缩设备。

4 讨论

选择澄清的目的是除去细胞碎片等大颗粒物质，选择澄清设备的要求是具有低蛋白吸附率、速度快、澄清度好。连续流离心机离心法虽然对鸡胚尿囊液的一次处理量在100万mL以上，但是连续流离心机澄清溶液的澄清度与澄清的速度成反比，澄清速度越快，澄清后溶液的澄清度越差。聚醚砜材质滤芯多用于澄清度较好溶液的澄清和除菌过滤，而对于溶液中含有大量的细胞碎片和血清来说，过滤过程中易出现堵塞现象。究其原因聚醚砜材质滤芯属于表面过滤，过滤过程中所有大于膜孔径的杂质很快就堵塞了膜孔径，因此这种材质的滤芯无法满足澄清度差的溶液工业化的澄清需要。双级玻璃纤维材质滤芯属于深层过滤、渐进结构，第一级膜孔径的范围6～40 μm，第二级膜孔径的范围0.45～2 μm，这样的构造使得不同分子量大小的杂质被分级拦截，这就是玻璃纤维材质滤芯容污能力强的原因。通过比较聚醚砜材质滤芯、双级玻璃纤维材质滤芯和连续流离心机，可以看出，无论是低蛋白吸附率还是澄清度方面，这三种方式均能达到要求，但由于离心方式和聚醚砜材质滤芯过滤方式耗时长、容污能力差，所以最终选定玻璃纤维材质滤芯作为澄清设备。

切向流浓缩系统有两种:一种是盒式膜即膜包浓缩系统，另一种是中空纤维管系统。两种系统均是以切向流方式进行浓缩的，盒式膜由于具有筛网，当料液流经筛网时，形成湍流效应，湍流效应的存在，使得透过流速增加，提高了浓缩效率，但也增大了对目的蛋白的剪切力；中空纤维系统由于不具有筛网，所以在相同流速下中空纤维系统产生的剪切力要比盒式膜小的多[8]。因此，盒式膜适合于性质稳定，能耐受机械损伤的料液，这样可以在高流速下运行，从而提高浓缩效率。而对于那些不耐受机械损伤的物质，更适合用中空纤维管系统进行浓缩。狂犬病毒只能耐受比较弱的剪切力，因为狂犬病毒分子表面的糖蛋白在剪切力作用下很容易脱落。而糖蛋白不但与病毒吸附和病毒毒力有关，而且是唯一能诱导机体产生中和抗体的表面抗原，所以糖蛋白的脱落势必导致狂犬病毒免疫原性的降低。从4批病毒液浓缩的效果来看，使用中空纤维浓缩病毒液的效价平均要高于膜包浓缩病毒液效价1～2 IU。该试验的结果证明了中空纤维在浓缩过程中对狂犬病毒的剪切力更小。

5 结论

狂犬病灭活疫苗下游工艺采取玻璃纤维材质滤芯和750 k膜孔径的中空纤维，进行澄清和浓缩，浓缩抗原经过β-丙内酯2℃～8℃灭活后进行凝胶过滤纯化，纯化抗原加入冻干保护剂冷冻干燥，突破了狂犬病冻干灭活疫苗下游工艺规模化生产的瓶颈，该生产工艺通过验证可以满足工业化生产。