响应面法制备黑曲霉浸膏水分散片剂及抗病促生作用

姚蒋庞，唐婧红，肖 洋，李 祝，赵妗颐，孙 冉

(1.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵阳 550025；2.贵州大学 生命科学学院，贵阳 550025；3.贵州省产品质量检验检测院，贵阳 550003)

黑曲霉(Aspergillusniger)是生物技术应用中非常重要的微生物，具有代谢旺盛、生长迅速、发酵周期短、无毒素产生、菌体和发酵产物不危害人畜健康，不影响环境等特点[1-2]。据研究报道，黑曲霉Y-1发酵液对西甜瓜细菌性果斑病有一定的防治效果[3]，黑曲霉代谢产物在盆栽试验中对番茄根结线虫有良好的防治效果，且对水稻稻瘟病菌等真菌性病害和魔芋白绢病菌等细菌性病害均有较强的抑制作用，表现出较广的抗菌谱[4-7]。李祝等[8-9]从土壤中分离出一株黑曲霉xj，研究其对细菌性根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和常见病原真菌腐霉菌(Pythiumpringsheim)、西瓜炭疽病菌(Colletotrichumorbiculare)和桔青霉(Penicilliumcitrinum)等均有抑制作用。这些研究表明黑曲霉是一种抗菌能力强、应用前景广阔的生防菌。

水分散片剂(WDT)是一种新型环境友好、易于生产加工、又利于拮抗菌存活的具广阔发展前景的农药剂型，水分散片剂型避免了粉剂在施用过程中粉尘飘移污染，定量不准的缺点[10-11]。唐婧红等[12-13]研制出黑曲霉孢子粉泡腾片剂且在盆栽试验中其对烟草的农艺性状有促进作用及对烟草青枯病的防治效果达92.9%。李祝等[14]研究发现黑曲霉发酵液具有很好的拮抗青枯菌的活性、耐高温，且在田间施用对病原菌起抑制作用等优点，但由于其液体的性质不宜大量贮存运输，长期贮存不当会受到杂菌污染。

本研究以黑曲霉xj发酵浸膏为试验材料，通过单因素试验、Plackett-Burman试验设计和中心组合试验设计[15]对黑曲霉浸膏水分散片剂进行制备工艺优化，并探讨黑曲霉浸膏水分散片剂对植株生长及抗病防治的影响，为黑曲霉开发为微生物农药奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

黑曲霉(Aspergillusniger)xj：由贵州大学真菌资源研究所分离，中国典型培养物保藏中心保藏，CCTCC编号 M206021；供试烟草品种为云烟87。

PDA 培养基：土豆 200 g，葡萄糖 20 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂 15～20 g；PDB 培养基：土豆 200 g，葡萄糖 20 g，蒸馏水 1 000 mL。

聚乙二醇6000(重庆茂业化学试剂有限公司)；聚乙烯吡咯烷酮K30(上海蓝季生物)；酒石酸(上海盛思生化科技有限公司)；碳酸氢钠(天津市永大化学试剂有限公司)；可溶性淀粉(河南圣斯德实业有限公司)；多黏类芽孢杆菌可湿性粉剂(武汉科诺生物科技股份有限公司)；SFY10液体发酵罐(江大科技有限责任公司)；EYELA N-1100旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；BIOMATE 3S紫外分光光度计(美国Thermo Fisher公司)；Allegra X-30R离心机(美国BECKMAN公司)。

1.2 黑曲霉浸膏水分散片剂的制备工艺优化1.2.1 黑曲霉浸膏的制备

取保存的黑曲霉xj菌株接种于PDA斜面培养基上，28 ℃培养7 d，制备最终浓度为107个/mL黑曲霉孢子悬浮液，按体积分数2%的接种量接种于PDB培养基中，28 ℃、150 r/min恒温摇床培养48 h，制成种子液4 ℃保存备用。

种子液按体积分数10%转接到装有80 L沙氏液体培养基的发酵罐中，28 ℃、150 r/min、通气量为1.5 L/min的条件下培养5 d终止发酵。过滤收集发酵液和菌丝体，得到的发酵液用旋转蒸发仪于45 ℃左右减压浓缩得到黑曲霉浸膏(含水率约为59%)，4 ℃保存备用。

1.2.2 黑曲霉浸膏水分散片剂(WDT)的制备工艺

将黑曲霉浸膏、酒石酸(崩解剂)、可溶性淀粉(填料)、聚乙二醇6000(润滑剂)和聚乙烯吡咯烷酮(黏结剂)混匀烘干，再加入碳酸氢钠(崩解剂)粉碎混匀，压片。

1.3 单因素试验

以黑曲霉浸膏水分散片剂崩解时间为指标，考察5个影响崩解时间的因素，得出单因素对崩解时间的变化规律，并确定5个单因素的最佳值。单因素试验采用固定参数分别为崩解剂比例1∶1、50%崩解剂、8%润滑剂、8%黏合剂、5%黑曲霉浸膏，因素变化范围分别为酸碱比1∶0.5～1∶2.5、30%～80%崩解剂、1%～13%黏合剂、4%～14%润滑剂、1%～13%黑曲霉浸膏。

1.4 响应面优化设计试验

1.4.1 Plackett-Burman试验设计

根据单因素试验结果，对黑曲霉浸膏质量分数、崩解剂比例、崩解剂用量、润滑剂用量和黏合剂用量等5个因素进行考察，每个因素选取高低2个水平，另设3个虚拟列，设计实验次数N=12的Plackett-Burman试验。

1.4.2 水分散粒剂最陡爬坡试验设计

根据1.4.1 Plackett-Burman试验结果和各种因素对响应值的影响，设计最陡爬坡试验的方向和步长。按照一定梯度改变浸膏质量分数、崩解剂比例、崩解剂用量，通过测定崩解时间确定以上3个因素的最适添加量。

1.4.3 中心组合试验设计

在前期试验结果基础上，根据响应面法的中心组合试验(central composite design, CCD)设计，选取浸膏质量分数、崩解剂比例、崩解剂用量等3个因素，采用三因素五水平的响应面分析方法，每个试验做3个重复，测定崩解时间。试验因素和水平见表1。

表1 中心复合设计(CCD)响应面设计的因素及水平编码表

1.5 黑曲霉浸膏水分散片剂质量检测

黑曲霉浸膏水分散片剂悬浮率测定按照GB/T 14825—2006进行，pH值测定按照GB/T 1601—1993进行检测；分别取制成的水分散片剂在室温条件下贮存，每隔3个月测定样品崩解时限、pH值和悬浮率，测定时长为12个月，评估黑曲霉浸膏水分散片剂的贮藏稳定性。

1.6 黑曲霉浸膏水分散片剂(WDT)对烟草抗病促生的田间试验

黑曲霉浸膏水分散片剂对烟草生长试验于2019年3月至7月在毕节、金沙地区试验基地进行，试验设3个处理如表2，每个处理设3个重复区组，以清水为对照。每区组60株烟株，行距1.2 m，株距0.5 m，随机区组排列。在烟草旺长期到田间取样，参照行业标准YC/T 142—2010《烟草农艺性状调查方法》调查其叶片数、最大叶长、叶宽、株高等农艺性状指标，并在烟草旺长期采集叶片，进行生理生化指标检测。烟草田间青枯病发病情况调查，参照GB/T 23222—2008《烟草病虫害分级及调查方法》，调查各处理的病情指数，并计算相对防效。

表2 不同处理的试验设计

1.7 数据处理

以Microsoft Excel 2010进行数据统计，采用Graphpad prism 5.0、Origin 17.0和SPSS Statistics 19.0软件进行数据统计分析，所有数据均为3次重复的平均值。

2 结果与分析

2.1 黑曲霉浸膏水分散片剂制备工艺优化2.1.1 单因素试验

黑曲霉浸膏水分散片剂在不同制备条件下崩解时间差异显著(P<0.05)，见图1。崩解剂比例对水分散粒剂的崩解时间具有显著影响，当崩解比例为1∶2时，崩解时间最短，且与其他比例比较差异显著(P<0.05)，见图1(a)。崩解剂用量也具有显著影响，当质量分数为40%时，崩解时间最短，其他处理组组间差异不显著(P>0.05)，见图1(b)。黏合剂用量有显著影响，质量分数为2%时，与其他处理组对比差异显著(P<0.05)，见图1(c)，且黏性好，干颗粒经过手捻能粉碎成有粗糙感的细粉，崩解时间符合农药剂型质量技术指标。润滑剂用量对水分散粒剂崩解时间具有显著影响(P<0.05)，见图1(d)，用量为6%时，能在压片中有效地改善颗粒或粉末的流动性，所得片剂的崩解时间最短，无黏冲现象。黑曲霉浸膏质量分数对水分散片剂崩解时间具有显著影响，选取黑曲霉浸膏质量分数为10%，考虑到水分散片剂药用使用效果，是在允许崩解时间内的最佳添加量，且处理组间差异均显著(P<0.05)，见图1(e)。

不同小写字母表示各组数据间差异显著(P<0.05)。

2.1.2 Plackett-Burman试验设计

表3、表4中A、B、C、D、E分别代表浸膏质量分数、崩解剂比例、崩解剂用量、黏合剂用量、润滑剂用量等5个因素对应的水平。5个因素中B、C 因素的可信度都大于90%以上，另外3个因素低于90%，综合来看，各因素对黑曲霉浸膏WDT崩解时间影响的主次顺序为C>B>A>E>D。

表3 Plackett-Burman试验设计表及其响应值

表4 Plackett-Burman试验结果统计分析

2.1.3 最陡爬坡试验

根据Plackett-Burman试验结果统计分析，A、B、C因素相关系数为正，说明其与崩解时间呈正相关，根据上述结果，设计出最陡爬坡试验方案及试验结果见表5。由表5可知，各因素在第6组试验附近取值时，崩解时间最快，因此采用崩解剂比例0.45、36%崩解剂、10%浸膏为后续响应面试验的中心点。

表5 最陡爬坡试验设计及结果

2.1.4 中心组合设计及响应面分析结果

根据最陡爬坡试验的结果，选择浸膏质量分数(A)、崩解剂比例(B)、崩解剂用量(C)等3 个因素，利用中心组合试验设计和响应面分析方法，中心组合试验响应值结果见表6。对其进行多元回归拟合分析得到响应值与浸膏质量分数(A)、崩解剂比例(B)、崩解剂用量(C)如多元二次回归方程所示：

表6 中心复合设计(CCD)响应面设计结果

Y=130.54+1.153A+2.215B+2.948C+0.35AB+1.10BC+0.90AC+11.264A2+10.892B2+9.549C2

由表7模型回归系数方差分析可知，方程因变量与自变量之间的线性关系明显，线性回归系数值P<0.01，表现为显著性；失拟项P=0.000>0.05，表现为不显著性，表明实验模型拟合度较好，并且复相关系数R2=97.69%，二次方程的拟合度高，自变量与响应值之间线性关系显著，说明此模型预测结果比较准确，能较准确的分析和预测工艺条件。

表7 回归方程的方差分析

2.1.5 各因素之间响应面交互作用分析

响应曲面图及等高线图直观反映各因素及其之间的交互作用(图2)。由响应曲面可知，随着制备条件中浸膏质量分数、崩解剂比例、崩解剂质量分数的改变，响应值均呈先降后升的趋势，由等高线图可知三者均有最小值且在试验范围内，通过对回归方程求一阶偏导数可得最佳值，即崩解剂比值为0.45 g，36%崩解剂，10%浸膏。利用优化后的工艺进行重复验证试验，黑曲霉浸膏WDT崩解时间为130.2 s，与预测值136.7 s拟合度高，验证了基于响应面法所得的优化条件参数的可靠性，具有实用价值。

(a)黑曲霉浸膏添加量；(b)崩解剂比例；(c)崩解剂用量。

2.1.6 黑曲霉浸膏水分散片剂(WDT)的性能指标测定

研制出的黑曲霉浸膏水分散片剂悬浮率为80.56%，pH 5.71，崩解时间为130.2 s，强度适中；黑曲霉浸膏水分散片剂在室温下储藏12个月，悬浮率为77.16%，pH 5.56，崩解时间为143.0 s，表明黑曲霉浸膏水分散片剂在常温下长时间储存也可以保持较高稳定性，各项指标均符合农药剂型质量技术指标。

2.2 黑曲霉浸膏水分散片剂(WDT)应用对烟草生长的影响

由表8、表9可知，浸膏水分散片剂处理的烟草叶片数、叶长、叶宽、茎围和株高均与清水(CK)间存在显著差异(P<0.05)。毕节地区施用浸膏水分散片剂后旺长期的叶片数、叶长、叶宽、茎围、株高分别比对照增加68.35%、9.54%、23.37%、66.40%和5.80%；金沙地区施用黑曲霉浸膏水分散片剂的烟草旺长期叶片数、叶长、叶宽、茎围、株高分别比对照增加89.83%、30.18%、29.38%、97.36%和16.30%。综上，黑曲霉浸膏水分散片剂应用于烟草有明显的促生效果。

表8 毕节地区不同处理旺长期农艺性状

表9 金沙地区不同处理旺长期农艺性状

2.3 黑曲霉浸膏水分散片剂(WDT)对烟草青枯病的田间防治效果

由表10 可知，试验结果表明施用黑曲霉浸膏水分散片剂对烟草青枯病的防治均有较好的效果，在清水+黑曲霉浸膏WDT处理时，防治效果为39.97%和38.9%，而黑曲霉浸膏水分散片剂的防治效果分别达到50.06%和50%，结果表明，在烟草苗床时期开始施用黑曲霉浸膏水分散片剂时达到的防治效果更好。

表10 不同处理对烟草青枯病的田间防治效果

3 讨论与结论

近年来，生物菌剂加工技术的改进与创新是农药发展重要的方面，传统生物菌剂剂型主要是乳油、可湿性粉剂和粉剂，其含有苯类有机溶剂及粉尘，对环境和人员造成了严重的污染和危害，而且田间试验性状表现极不稳定，随着现代社会对环保越来越重视，传统生物菌剂剂型对环境存在一些不容忽视的影响[16-17]。农药水分散片剂是一种较新颖的剂型，由原药、适宜的助剂和填料混合均匀造粒所形成的[18]，与传统的剂型相比，解决了田间条件下可湿性粉剂的接触和呼吸毒性、粉剂使用时粉尘飞扬的危害和乳油易燃问题和使用时芳烃溶剂对皮肤的接触毒性问题；且具有运输、使用方便，易计量且崩解快等优点，以环境友好性、工艺简单、生产设备投资费用低等优势，在生产上具有广泛的应用前景[10]。水分散片剂的贮存稳定性直接影响其产品质量与应用效果，选择合适助剂可以提高微生物菌剂的崩解速度和贮存稳定[19]。马超等[20]利用干法压片工艺研制出21%丙草胺·二氯喹啉酸·苄嘧磺隆除草剂，入水具有优异的崩解分散性能，筛选出其崩解剂比例为0.6；杨景涵等[21]采用直接压片法研制10%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐杀虫剂，崩解时间短、硬度大和表面光滑，筛选出聚乙烯吡咯烷酮黏合剂6%，聚乙二醇6000 润滑剂6%。王小兵等[22]研制出复合芽孢杆菌水分散粒剂，具有优异的分散性能及有效防治辣椒青枯病；Wiwattanapatapee等[23]将聚乙烯吡咯酮、柠檬酸、酒石酸和碳酸氢钠组合制备得到芽孢杆菌泡腾剂，崩解性能优异。在我国，剂型的研究主要集中于化学农药的制备，而真菌微生物农药剂型的报道较少，本研究通过对黑曲霉浸膏水分散片剂的工艺优化，在崩解剂比值0.45、36%崩解剂、2%黏合剂、6%润滑剂条件下制备得到的10%黑曲霉浸膏水分散片剂，其外观整齐、表面光滑，悬浮率80.56%，pH 5.71，崩解时间为130.2 s。且该制剂生产成本低，使用方便，为黑曲霉农药开发的产业化奠定了技术基础。

通过使用微生物大量生命活动的产物或有效活性成分，生物菌剂可改善作物营养条件和生长环境，促进作物生长发育，抵抗病虫危害，提高农产品产量和品质[24-25]。宋志伟等[26]报道微生物制剂显著提高草莓促生、增产作用；微生物菌剂施用能改善土壤性质、防治病害及促进生长发育，提高其株高，增加单株叶片数、维生素C含量和产量[27-29]。本研究黑曲霉浸膏水分散片剂的施用，对烟草植株的叶片数、叶长、叶宽、茎围和株高都有明显的促进作用，毕节地区施用浸膏水分散片剂后旺长期的叶片数、叶长、叶宽、茎围、株高分别比对照增加68.35%、9.54%、23.37%、66.40%和5.80%；金沙地区施用黑曲霉浸膏水分散片剂的烟草旺长期叶片数、叶长、叶宽、茎围、株高分别比对照增加89.83%、30.18%、29.38%、97.36%和16.30%。在大田试验中，研究发现黑曲霉浸膏水分散片剂对烟草青枯病的防治效果达到50%以上，且有良好的抗病促生效果，且该制剂生产成本低，使用方便，为微生物菌剂的产业化奠定了技术基础。