自然堆肥过程中可培养细菌群落多样性的研究

王志慧，刘炳炎，黄彩霞，邱鹏滢，潘宇睦，郑文珺，王俊涛，芦光新

(青海大学，青海 西宁 810016)

目前，随着种植业和养殖业的规模化、集约化发展，以玉米、小麦、稻谷秸秆和畜禽粪便为主的农业废弃物大部分被随意弃置，造成了有机肥资源巨大的浪费及较为严重的环境污染[1-3]。因此，如何合理处置农业废弃物以减少对环境的污染就显得尤为重要。为响应国家绿色环保的发展政策，针对畜禽粪便的处理，好氧堆肥发酵是最有效可行的方式之一。高温好氧堆肥是在合适的条件下利用多种微生物将固体有机物进行分解并逐步转化为稳定腐殖质的复杂生物学过程[4]。黄继川等[5]利用盆栽试验发现，化肥与堆肥配施能够改善土壤的酸度，提高养分的有效性，有利于作物的吸收。仝少伟等[6]采用啤酒污泥、牛粪和菇渣进行堆肥试验表明，以含有活性小颗粒啤酒污泥堆肥对土壤呼吸和微生物生物量碳、氮、磷的影响最为明显。堆肥中微生物数量及种群分布与多种因素有关[7]，了解堆肥过程中微生物变化对于缩短堆体腐熟时间具有重要意义。目前,关于自然堆肥过程中可培养细菌群落多样性等方面的研究甚少。鉴于此，本研究将新鲜猪粪与油菜秸秆按照一定比例混匀自然堆肥，同时对自然堆肥中的温度变化，可培养细菌的种类和多样性进行分析，旨在探讨自然堆肥过程中微生物的变化与发酵过程的关系，以期为后续堆肥提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

1.1.1 试验材料 新鲜猪粪，油菜秸秆(将其粉碎至粒径1～3 cm)。

1.1.2 试验设计 将新鲜猪粪与油菜秸秆按照质量比3∶1混匀，调节含水率为60%～70%，堆成底部直径1 m、高0.7 m的圆锥形。C/N比控制在25∶1～30∶1。堆肥时间从6月1日至7月17日，整个堆肥阶段为47 d。每4 d翻堆前取样，样品均从堆体内部选取，从每堆上、中、下三个方向的纵切面进行取样，混匀后装入样袋进行后续测定，共取样12次。

1.2 细菌培养与测定

1.2.1 牛肉膏蛋白胨(NA)培养基制备 牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂粉18 g，蒸馏水1 L，pH 7.0～7.2。

1.2.2 可培养细菌的分离及纯化鉴定 将1 g样品加入至99 mL灭菌的蒸馏水中，配制成悬浮液(加入链霉素抑制非目标培养物)，利用常规培养手段进行细菌培养，期间观察菌落形态，最后选取不同形态的群落进行纯化、保存、鉴定。

1.2.3 微生物菌落测定 采用平板计数法进行菌数测定。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 温度的测定 分别在每天上午10：00和下午15：00使用温度计测量堆体上、中、下层的温度，计算其平均值并做好记录。本试验温度划分为升温阶段:堆肥初期，温度不断上升；高温阶段:温度上升至50 ℃以上,并保持一段时间，随后又逐渐降低；降温阶段:高温后温度逐渐下降并稳定；腐熟阶段:处于堆肥后期，堆体的含水量降低，无刺激性气味，堆体呈黑色或棕黑色。

1.3.2 菌种鉴定

(1)菌株基因组DNA的提取。用接种环蘸取经纯化的菌落放入液体营养琼脂培养基中，35 ℃、120 r/min 条件下振荡，至培养基由澄清变为浑浊，制备的菌液用于提取细菌DNA。菌株DNA采用Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒(编号：B518255-0050)进行提取，采用16S rDNA的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′)进行扩增。PCR扩增条件：模板DNA 1 μL，上下游引物各2 μL(浓度10 μmol/L)，2X SanTaq PCR Mix 25 μL，ddH2O 20 μL；反应程序：94 ℃、5 min；94 ℃、1 min，57 ℃、1 min，72 ℃、1.5 min，30个循环；72 ℃、15 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

(2)菌株16S rDNA序列分析。将测序所得的序列用Contig Express软件做序列拼接，在NCBI网站上进行比对，下载同源性高的序列及模式菌株的序列，选用MEGA 7.0软件上的Clustal W功能进行序列比对，用邻接法(NJ)构建系统发育树，bootstrap值设为1 000。

1.4 群落结构特征分析

细菌群落结构特征用物种丰富度、相对多度、Simpson优势度、Shannon多样性指数、Pielou均匀度指数等指标[8-10]表示：

物种丰富度(S)即群落中的物种数，指自然堆肥中样品分离得到的细菌属级物种数。

相对多度(Pi)指群落中某一物种的多度占所有物种的多度之和的百分比。

Pi=Ni/N

式中：N为物种总数；Ni为第i物种个体总数(本文以属级为单位统计菌落数)。

Simpson优势度(D指数)在生态学中主要反映群落中最常见的物种，评估微生物群落丰富度。

Shannon多样性指数(H指数)在生态学中用来估算群落多样性的高低。

式中：H′为物种的多样性指数；S为物种(本文为属级单位，下同)总数；Pi为第i种物种个体数占群落总个体数的比例。

Pielou均匀度指数(J指数)在生态学中用来反映物种丰富度。

J=H′/lnS

式中：J为均匀度指数；H′为Shannon多样性指数；S为物种种数。

1.5 数据统计分析

采用Excel 2003进行数据整理，利用DPS6.55对数据进行ANOVA检验。

2 结果与分析

2.1 自然堆肥中温度的变化

由图1可知，堆体整体的温度变化趋势大致为先升高后下降。1～2 d为升温阶段，堆体初始温度为48.3 ℃，之后温度不断上升，第2天温度升至51.5 ℃；3～27 d为高温阶段，随着堆肥时间的延长，温度持续升高，第8天堆体最高温度达到最大值，为68.0 ℃，此阶段平均温度为59.5 ℃；28～39 d为降温阶段，该阶段的温度随堆肥时间的持续开始下降，平均温度为49.7 ℃；此后堆体进入腐熟阶段，该阶段因微生物的活动减少而导致温度下降，平均温度为32.9 ℃。在整个自然堆肥过程中温度>50 ℃共有28 d，符合GB 7959—2012《粪便无害化卫生标准》[11]。

图1 自然堆肥发酵的温度变化Fig.1 Temperature variation of natural composting fermentation

2.2 自然堆肥中可培养细菌菌落数及物种数

经16S rDNA分子鉴定后，分离得到的可培养细菌种类共有16属，细菌菌落数总计29 108个(表1)，其中微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphila)的菌落数最多，占总细菌菌落数的30.62%；其次为沙门氏菌(Salmonellabongori)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，分别占总细菌菌落数的20.32%和20.21%；其余13种细菌的菌落数较少，占总细菌菌落数的28.85%。

表1 自然堆肥中可培养细菌物种数量及所占比例

表2为自然堆肥中细菌数量及物种数的变化情况。由表可知，堆体初始温度为48.3 ℃，此时堆体处于升温阶段(<50 ℃)，菌落数为4 738个，物种数有5种。3～27 d为高温阶段(>50 ℃)，其中第8天的温度为68.0 ℃，第21天的温度为57.0 ℃，物种数均有6种；第12天的温度为53.7 ℃，细菌菌落数最多，达到5 776个。第28天之后，堆体温度下降并开始腐熟，直至堆肥结束，温度为29.2 ℃，细菌菌落数有2 075个，物种数有2种。由此可知，随着堆肥时间及温度的变化，堆体细菌菌落数和物种数逐渐减少。

表2 自然堆肥中细菌数量及物种数变化

2.3 自然堆肥中不同菌株(属)优势度比较

某物种占整体物种的比例≥0.1为优势属，0.01～0.1为常见属，≤0.01为稀有属[12]。由图2可知，16个菌株中，微嗜酸寡养单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和植物内生赖氨酸芽孢杆菌等4种菌为优势种；弗氏大肠杆菌、消化链球菌、嗜酸酸杆菌、热带芽孢杆菌、米曲芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌等6种菌为稀有种；大肠杆菌、沙门氏菌、海洋芽孢杆菌、不动杆菌、婴儿芽孢杆菌和花椒芽孢杆菌等6种菌为常见种。

图2 自然堆肥中可培养细菌菌株优势度Fig.2 Dominance of culturable bacterial strain in natural composting

2.4 自然堆肥中可培养细菌群落多样性分析

由表3可知，在自然堆肥过程中，微嗜酸寡养单胞菌的Simpson优势度最大，显著高于其他菌株(P<0.05)；沙门氏菌的Shannon指数、Pielou指数最大，且与其他菌株存在显著差异(P<0.05)。微嗜酸寡养单胞菌生长的最适温度为30 ℃[13]，沙门氏菌为37 ℃[14]，且在前两次样品微生物培养中菌落数较多，分别为2 247个和1 063个(表4)，此时堆体处于高温阶段，大部分的嗜温细菌(超过60%)能够在堆肥的高温期分离出来[15]。随着堆体发酵时间的持续，整体上细菌菌落数逐渐减少，直至消失。由此可见，物种多样性与堆肥温度有关。

表3 自然堆肥中可培养细菌群落多样性

表4 自然堆肥中样品菌落数统计表

3 讨论与结论

温度是堆肥过程中非常重要的变量[16]。有研究表明，堆肥最佳温度一般保持在50～60 ℃，此温度范围内有利于杀死粪便中的病原菌。过低的堆肥温度(<40 ℃)能够抑制微生物活动，延长堆肥腐熟的时间；过高的堆肥温度(>70 ℃)将对堆肥微生物产生有害影响[17]。堆肥温度高于55 ℃必须保持3 d以上，才能杀死病原菌，达到无害化标准[18-19]。本研究的堆肥温度连续有9 d高于55 ℃，堆肥内的病原菌已被有效杀死。C/N是有机肥发酵过程中的一个关键因素，不合适的C/N会影响微生物的生长、有机物的分解和发酵时长[20]。黄国锋等[21]提出堆肥起始的C/N在25∶1～30∶1为堆肥的最佳条件。本试验中自然堆肥的C/N控制在25∶1～30∶1，且高温阶段维持在50～60 ℃的时间较长，说明自然堆肥的发酵效果良好。

在发酵过程中，细菌可以将堆肥物质分解转化为有机物并伴随热量的产生。在本次堆肥试验的发酵过程中，细菌数量整体呈“下降—升高—下降”的趋势，在高温阶段菌落数与物种数增加，这与刘佳等[22]的研究结果不一致，可能是因为试验材料和环境不同导致微生物群落变化存在差异。本试验在前中期的时候，细菌数量急速上升，温度也不断上升，最高温度达到68 ℃。这是由于升温阶段堆肥内的微生物可以利用现有的营养物质进行快速繁殖，使菌群数量急速增加；微生物因活动而产生热量，使得温度随着发酵时间的延长逐渐升高。另外，在自然堆肥过程中发现，升温阶段微嗜酸寡养单胞菌和沙门氏菌占主导地位，这可能是由于嗜温细菌在高温阶段形成了微菌落的原因。随着嗜热细菌活性的减弱，堆肥的温度开始降低，嗜温细菌又开始占主导地位[14]。

综上可知，本研究通过对自然堆肥过程中可培养细菌群落多样性的研究，发现在堆肥发酵过程中，前中期阶段细菌的主要优势菌以微嗜酸寡养单胞菌属、沙门氏菌属和解淀粉芽孢杆菌属为主；随着发酵时间的延长，微嗜酸寡养单胞菌属、沙门氏菌属和解淀粉芽孢杆菌属的数量逐渐减少甚至消失；堆肥后期以芽孢杆菌属(枯草芽孢杆菌属和花椒芽孢杆菌属)为主。本研究结果为自然堆肥可培养细菌的后续菌落特征研究提供一定的理论参考。