L-色氨酸-Hg2+-青霉胺体系的荧光光谱及分析应用

闫晶晶， 张甜， 胡咏梅， 李政， 刘剑雄， 胡小莉

1.西南大学 化学化工学院，重庆 400715；2.成都市第二人民医院，成都 610017

青霉胺(3，3-二甲基半胱氨酸，PA)是青霉素的代谢产物，也是一种含巯基氨基酸[1].同时青霉胺也是一种具有药理作用的手性化合物，用于治疗多种疾病，如威尔逊氏病、类风湿性关节炎、硬皮病及重金属中毒等[2].青霉胺作为手性化合物，存在D-青霉胺(D-PA)和L-青霉胺两种对映异构体，它们的药效及毒理作用差别很大，其中L-PA有一定毒副作用，只有D-PA有治疗疾病的作用.世界卫生组织已经将D-PA列为基础医疗中的必备药品.因此，建立简单、快速、高灵敏、高选择检测D-PA的方法具有重要意义.目前报道的检测D-PA的主要方法有电化学发光[3]、电化学法[4]、分光光度法[5]、HPLC法[6]、圆二色性法[7]和离子色谱法[8].此外，荧光光谱法相比于其他方法更简单、高效，且灵敏度更高.近年来，已有较多测定D-PA的荧光法报道[9-11]，但是有的荧光探针合成步骤复杂繁琐，限制了方法的使用.本研究利用一种简单易得的荧光探针来检测D-PA.研究发现，L-色氨酸(L-Trp)在352 nm处有很强的荧光发射峰，随着Hg2+的加入，L-Trp荧光被猝灭.接着加入D-PA，L-Trp的荧光得到恢复，据此建立了一种“开-关”模型来检测D-PA，其反应机理见图1.

图1 L-Trp测定D-PA的反应机理

1 实验部分

1.1 实验仪器与材料

Hitachi F-2500型荧光分光光度计(日立科学仪器有限公司，日本)；UV-2450型紫外-可见分光光度计(岛津公司，日本)；pHSJ-4F酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司，上海).

L-Trp、D-PA(阿拉丁试剂有限公司，上海)；HgCl2(四川科伦医药贸易有限公司，成都)；Britton-Robinson缓冲溶液：2.71 mL 85% 磷酸(重庆北碚化学试剂厂，重庆)，2.36 mL 冰醋酸(重庆川东化工有限公司，重庆)和2.47 g 硼酸(重庆北碚化学试剂厂，重庆)溶于1.0 L蒸馏水中，用0.2 mol/L NaOH调节不同pH值.实验过程中所用水均为超纯水.

1.2 实验方法

在10.0 mL的比色管中依次加入pH=4.8的BR缓冲溶液1.0 mL，0.5 mL 4.0 × 10-4mol/L L-色氨酸，0.5 mL 1.0 × 10-2mol/L Hg2+和一系列不同浓度的D-PA，用蒸馏水定容至刻度后摇匀，在室温下静置15 min.在荧光分光光度计上以λex=275 nm激发，进行波长扫描，记录体系的荧光光谱，并在波长352 nm处测定样品和试剂空白的荧光强度，ΔF=F-F0.狭缝宽度为10 nm.

2 结果与讨论

2.1 荧光光谱

以最大激发波长275 nm对L-Trp溶液进行荧光光谱扫描，发现其最大荧光峰位于352 nm处(图2中曲线1)，而Hg2+和D-PA均无荧光.L-Trp与D-PA溶液混合，L-Trp的荧光强度几乎没有变化(图2中曲线2).然而，在一定浓度的L-Trp中加入适量Hg2+后，由于Hg2+与L-Trp 结构中的羧基结合，使得L-Trp在352 nm的荧光猝灭[12](图2中曲线4)，接着向溶液中加入与Hg2+结合能力更强的D-PA，L-Trp被释放出来，溶液荧光逐渐得到恢复(图2中曲线3).

1.L-Trp；2.L-Trp+D-PA；3.L-Trp+Hg2++D-PA；4.L-Trp+Hg2+；cL-Trp=2.0×10-5 mol/L； mol/L；cD-PA=5.0×10-5 mol/L；pH=4.8.

2.2 反应条件优化

2.2.1 pH值的影响

实验探究了不同pH值的BR缓冲溶液对反应体系的影响.由图3可知，L-Trp-Hg2+和L-Trp-Hg2+-D-PA两个反应体系的荧光强度在pH=2.0～3.1范围逐渐增强，pH=3.1～7.2之间荧光逐渐减弱，但荧光恢复值(ΔF)在pH=4.0～5.0时最大(图3插图).因此本实验选用pH=4.8的BR溶液为反应介质.

a.cD-PA=2.0×10-5 mol/L；b.cD-PA=0.

2.2.2 Hg2+浓度的影响

L-Trp作为一种常见天然氨基酸，已有文献报道Hg2+可以与羧基螯合从而猝灭L-Trp的荧光[13].如图4所示，在Hg2+浓度为4.0×10-4mol/L时，L-Trp荧光猝灭程度最大，且随着Hg2+继续加入，荧光强度保持不变.故本实验选择5.0×10-4mol/L为Hg2+后续实验浓度.

cL-Trp=2.0×10-5 mol/L；pH=4.8.

2.2.3 离子强度和反应时间的影响

研究了离子强度对三元反应体系的影响(图5)，当NaCl浓度低于4.0×10-4mol/L时，反应体系荧光强度较稳定；当NaCl浓度高于4.0×10-4mol/L时，荧光强度有所增加，因此，在实际样品检测过程中要注意控制离子强度，避免高浓度盐类的引入.此外，实验发现L-Trp的荧光在15 min恢复到最大值并且在1 h内保持稳定，因此选择15 min为反应时间.

cL-Trp=2.0×10-5 mol/L， mol/L，cD-PA=5.0×10-5 mol/L，pH=4.8.

2.3 方法的选择性

为了考察该方法的选择性，在优化的实验条件下，探究了20种常见物质对测定D-PA的影响.当共存物质引起的荧光强度改变在相对误差±5%之内，通常认为不会对检测造成影响.由表1可知，常见的金属离子、氨基酸、糖类对D-PA的检测几乎没有影响，表明本法具有较好的选择性，可以应用于实际样品的检测.

表1 共存物质的影响(cD-PA=5.0×10-5 mol/L)

2.4 标准曲线

按照前述实验方法，测定不同D-PA浓度下反应体系的荧光强度.如图6所示，随着D-PA的加入，L-Trp的荧光逐渐恢复，荧光恢复程度(ΔF)与D-PA浓度在0.44～50.0 μmol/L范围内呈现良好的线性关系(图6插图)，线性回归方程为ΔF=226.6C+51.8，相关系数为0.999 3，检出限(3σ/K)达0.13 μmol/L.表2列出了本法与其他方法测定D-PA的比较，由此可以看出，本法灵敏度高，操作简单，更具有实用价值.

cL-Trp=2.0×10-5 mol/L， mol/L，cD-PA×10-5 mol/L/a-f=0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0.

表2 测定D-PA的不同方法的比较

2.5 逻辑门的模拟应用

分子传感器与目标分析物协同作用，对反应条件进行信息处理，将一个或多个反应条件作为输入信号，荧光信号的改变作为输出信号[14].基于荧光响应可以通过Hg2+和D-PA的加入来回切换，体系荧光强度进入“on-off-on”模式，为此构建了IMPLICATION逻辑门[15].以 L-Trp作为一种逻辑门装置，设定Hg2+(输入1)和D-PA(输入2)为输入信号，352 nm处荧光强度为输出信号，0和1分别代表荧光猝灭和未猝灭.无信号输入(0，0)或只有D-PA输入(0，1)，352 nm处荧光吸收很强，输出为1；单独Hg2+输入(0，1)时，荧光猝灭，输出为0.当两者同时输入(1，1)时，L-Trp荧光恢复，输出为1.表3为逻辑门对应的真值表，图7为荧光输出IMPLICATION逻辑图.

表3 逻辑门真值表

图7 IMPLICATION逻辑图

2.6 实际样品的测定

为了评价本方法的适用性和有效性，将本方法用于青霉胺药片中D-PA含量检测.随机选10片药片(上海信谊药厂有限公司)，研细.称取相当于0.25片质量的样品，溶解、过滤、除去不溶物，最后定容至500.0 mL容量瓶中，备用.吸取0.5 mL待测液于10.0 mL比色管中进行检测，结果见表4.通过标准加入法测得回收率和相对标准偏差分别为96.0%～103.8% 和2.8%～4.0%，表明本方法具有较高的准确度和较好的重复性，可以用于实际样品的测定.

表4 药片中D-PA的测定结果

3 结论

利用Hg2+与D-PA之间的强螯合作用，使得Hg2+脱离L-Trp，L-Trp荧光得到恢复，从而设计了分子逻辑门，并建立了D-PA的荧光检测新方法.本方法相较于其他方法，简单易行、选择性好、灵敏度高，无需精密的仪器和复杂的合成步骤，适用于青霉胺药片含量的测定.