MALDI-TOF MS在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌同源性分析的应用研究

张杰 张金鑫 楚新旭 应冲涛 郭普 汪华学,*

(1 蚌埠医学院第一附属医院重症医学科，蚌埠 233004；2 蚌埠医学院第一附属医院疼痛科，蚌埠 233004；3 蚌埠医学院第一附属医院检验科，蚌埠 233004)

近年来随着碳青霉烯类药物的广泛及不合理应用，引起耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)的检出率不断增长，为临床诊疗带来了巨大的风险与挑战[1-2]。通过分析CRKP的同源性，便于明确CRKP的流行病学分布和扩散方式，为临床感染防控及疾病诊疗提供依据。脉冲场凝胶电泳(PFGE)作为现今最常用于鉴定细菌分型的分子生物学技术之一，通过分析菌株间的同源性，能够有效识别院内CRKP引起的感染流行与暴发规律，但由于操作复杂、耗时、实验条件苛刻等因素制约，常规医疗机构少有开展[3]。目前MALDI-TOF MS作为快速筛选菌株种属的新工具，具有高通量、时效高、误差小、性价比高等优势，为诊疗提供强大的技术支撑[4]。MALDI-TOF MS除用于种属鉴定外，也可用于在同源性的分析比较，通过质谱峰进行聚类分析便可快速监测耐药菌株的流行病学分布，为耐药菌株的院内感染控制提供指导意见[5]。本研究应用MALDI-TOF MS采集CRKP菌株的质谱图，利用自带的SARAMIS软件分析菌株间的同源性，PFGE作为分组标准，旨在评价MALDITOF MS进行同源性分析的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

收取某院2018年9月—2020年10月在微生物室分离自痰、血液、尿液及胸水等标本的肺炎克雷伯菌295株(除去同一病患相同部位的重复菌株)，其中分离自痰标本130株，血液标本62株，尿液标本27株，胸水标本31株，分泌物标本33株，脑脊液标本12株。科室来源见表1。质谱质控菌株：大肠埃希菌ATCC8739；标准菌株：大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705。菌株均保存于-80℃冰箱中。

表1 295株肺炎克雷伯菌的科室来源Tab.1 The department source of 295 Klebsiella pneumoniae strains

1.1.2 仪器与试剂

MALDI-TOF MS、48孔靶板及麦氏比浊仪购自法国Bio-Merieux公司，PFGE电泳仪及成像仪源自美国Bio-Rad公司；MH平板和哥伦比亚血琼脂平板购自合肥天达试剂公司，CHCA基质液购自法国Bio-Merieux公司；美罗培南(10 μg)及亚胺培南(10 μg)药敏卡片购自英国Oxoid公司；蛋白酶K和XbaI内切酶购自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养及种属鉴定

从-80℃冰箱选取保存的菌株，按三区划线，接种至哥伦比亚血琼脂平板上，放在37℃温箱中过夜培养后，再次分纯培养。挑取单一菌落，应用甲酸提取法萃取出菌株蛋白，取1 μL上清液滴至48孔靶板上，一菌两孔，最后挑取ATCC8739单一菌落，均匀涂抹在中间靶孔上，用于图谱校准。然后，分别加1 μL CHCA液覆盖靶孔上，晾干后利用MALDITOF MS自带的RUO系统，以线性、正离子模式，调整频率50 Hz，在质荷比2000～20000 Da内收集图谱。将得到的峰度与数据库对比，重新鉴定至种水平。

1.2.2 耐药表型分析

挑取单个纯菌落，应用麦氏比浊仪配至0.5 CFU/mL的菌悬液，接种至MH平板，37℃温箱中孵养16～18 h，结果参照2020版CLSI M100 30th药敏标准执行，其中美罗培南或亚胺培南的抑菌圈直径≤19 mm，筛选为CRKP。

1.2.3 PFGE分析

按照文献[6]方法所述，将筛选出的CRKP菌株，挑取新鲜纯菌落至缓冲液中，震荡摇匀15s，制成4个麦氏浊度的菌液，通过裂解、洗胶、酶切、上样，接着电泳获得图像，最后利用BioNumerics软件分析同源性。结果根据文献[7]判读：①条带完全一样为同一型；②1～3个条带有差异为同一型的不同亚型，表示高度有关；③4～6个条带有差异定为不同型别，表示可能有关；④≥7个条带有差异定散发菌株，表示不相关。

以PFGE同源性分析作为分组标准：①高度同源组：相似性＞85%；②中度同源组：相似性介于70%～85%；③低度同源组：相似性＜70%。

1.2.4 MALDI-TOF MS分析同源性

参照“1.2.1”方法获取待分析CRKP的质谱图，取2000～20000质荷比为分析区间，将数据导入SARAMIS软件中，应用Taxonomy工具中的相似性分型和identical mass分型进行图谱的分析比较。

2 结果

2.1 PFGE结果

经耐药表型共筛选出55株CRKP；PFGE对其进行聚类分析，得出同源性分析树状图(图1)，PFGE的分型、检出结果及菌株来源见表2。

表2 PFGE的分型、检出结果及菌株来源Tab.2 Classification, detection results and source of PFGE

2.2 3组分析比较

2.2.1 高度同源组

本组大多数KPN菌株同源性高度集中，根据PFGE结果，相似性均＞85%(图1)；采用SARAMIS软件的identical mass分型(图2A)，菌株大多集中分布于60%～80%，均属于A型，且A1型identical mass部分高于80%(HF516、HF518、BY261、BY281),其中发现HF1676与同型KPN相比，在identical mass分型中差异性较大，对高度同源组造成了一定的影响。通过相似性分型发现(图2B)，PFGE相似性大于85%的菌株同源性大多集中，大多A型菌株相似性＞80%，这与PFGE结果一致性较高，然而HF281和BY217为A型菌株，但在相似性分型却小于70%，差异性较大。

2.2.2 中度同源组

该组PFGE同源性介于70%～85%之间，菌株分型主要属于A型(图1)，但菌株之间具有一定的差异。应用identical mass分型(图3A)和相似性分型(图3B)发现，主要菌株之间的identical mass＞70%，相似性＞85%，表明KPN之间同源性较高，这与PFGE结果严重不符，存在较大差异。

2.2.3 低度同源组

此组PFGE分析差异性较大，均＜70%，分型各自不同，属于散发性(图1)。采用identical mass分型(图4A)和相似性分型(图4B)分析同源性，显示KPN之间identical mass＜70%，相似性＜80%，与PFGE分析相似，能较好体现菌株间的差别。

3 讨论

肺炎克雷伯菌是常见的肠杆菌科细菌，常导致肺部、肠道、甚至血流等感染[8]。β-内酰胺类抗菌药物是治疗肺炎克雷伯菌感染的首选抗菌药物，而碳青霉烯类抗生素被认为是最后的选择。但是，随着临床上抗生素的广泛应用及不合理使用，碳青霉烯类的耐药率呈上升趋势[9]。CHINET监测发现2005—2018年KPN对美罗培南和亚胺培南的耐药率从2.9%和3.0%增加到26.3%和25.0%，13年来增加约9倍[10]。因此，及时发现、有效控制CRKP的流行趋势与暴发至关重要。

现今，临床微生物实验室在细菌同源性分析的方面主要以分子生物学分型居多，其中PFGE作为一直比较公认的分型技术，具有较高的精确度和稳定性[11-13]。但该技术由于操作繁琐、耗时长、费用高等缺点，不作为临床实验室常规设备和技术手段。为了快速明确耐药菌的分布与流行规律，医院迫切需要一种能够快速溯源、加强疾病防控的时效性和应对能力的新技术。近年来，MALDI-TOF MS作为一种快速鉴定病原菌种属的新技术，能通过分析菌株间蛋白丰度的细小差异，达到快速分析细菌同源性的目的，进而追根溯源[14]。有研究发现[5]，利用MALDI-TOF MS筛选出CRKP的特征质量峰，应用自带的Clinpro Tools 3.0软件分析比较菌株间的特征质量峰，作为其同源性分析的鉴定标准。王璐等[15]研究利用MALDI-TOF MS收集临床分离的CRKP菌株，通过自带的SARAMIS软件对待测菌株进行同源性分析，发现40株CRKP以A型为主，占85%(34/40)，认为该医院存在以A型CRKP为主的流行传播。在本研究中，运用SARAMIS软件的分型工具，高度同源组identical mass大多介于60%～80%之间，分布较为集中，相似性＞80%，与PFGE分析基本相似，这在菌株一致性和非一致这两方面上，均能较好得反映院内病原菌流行趋势。然而，在中度同源组中，质谱分析结果与PFGE分析具有较大差异，这表明MALDI-TOF MS在同源性分析上具有一定的不稳定性。结果分析：PFGE的分型原理是通过电场的不断变化，带动不同菌株基因组DNA序列的泳动方向，形成电泳条带，最终达到细菌分型的目的，其本质是微观变化的宏观显示，但对于分析含有复杂DNA序列的菌株，易受到相互影响，并且PFGE操作繁琐、耗时，电泳条带易受到缓冲液的配制、电泳时间、电压、操作者的技术水平等因素受限，且常规医院少有配置有关设备[11]；PFGE作为本实验研究目的的衡量标准，仍存在一定的局限性，后续实验仍需通过其他常用分型技术验证菌株分型结果的准确性；MALDI-TOF MS分析菌株间的同源性是基于病原菌的蛋白质表达丰度[16]，通过比对系统自带的数据库得出质谱峰结果，从而得出同源性结果，其结果受到临床菌株来源、抗生素选择压力、实验室环境、操作者的娴熟水平及待测菌株活性等因素制约，某些菌体可能存在不表达或表达过多，导致SARAMIS软件分析的准确性不高。在中度同源组分析中，根据PFGE分型结果，显示菌株之间分型大多不同，且根据图1的同源性树状图发现，本组同源性大多介于70%～85%；应用SARAMIS软件，identical mass分型分析同源性，只有编号HF6791、HF1285、HF2148这3个菌株介于70%～85%，而相似性分型大多＞85%，这与PFGE的同源性树状图比较，不能较好显示出不同亚型及型别之间的一致性和不同时期播散的差异性；对于同源性较高和较低的菌株，能大致进行分型初筛。

本研究将临床分离的55株CRKP划分为3组菌株：在高度及低度同源组分析中，对于菌株间的暴发流行与散发性，SARAMIS软件能进行粗略的初筛；在中度同源组中，尚不适用；但该技术仍存在一定的不稳定性。由于本研究样本量不多，其中部分菌株来源于同一科室，不能排除CRKP小范围克隆传播的可能，对实验结果具有一定干扰性。并且，研究样本的PFGE分型结果有限，仅限于监测菌株来源的院内流行趋势，后续应收集不同菌株型别，探究质谱分析CRKP同源性的应用价值。此外，MALDI-TOF MS采集的质谱峰数量较多，部分存在不足，其中峰度干扰、噪声、重复性低等因素均对分析结果造成一定的影响。因此，后续应当进一步增加研究对象的样本量，扩大CRKP的菌株来源，从而完善MALDI-TOF MS分析CRKP同源性的稳定性和可重复性。

综上所述，采用MALDI-TOF MS研究CRKP的同源性，在一定程度上能够快速追根溯源，从而增强院内病原菌流行防控的时效性，但对于同源性复杂的实验菌株，稳定性不高，其应用价值需进一步研究，仍需更准确的同源性分析技术明确流行规律，从而采取适当措施，严格控制进一步的暴发。