动物源性食品中地塞米松残留检测技术的研究进展

周 芳，邢晓玲，余春苗，周 洲，王 薇

（江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300）

地塞米松（Dexamethasone）又称氟美松、氟甲强的松龙，是一种人工合成的糖皮质激素，属于甾体类化合物，在兽医临床中常用到醋酸地塞米松和地塞米松磷酸钠。醋酸地塞米松为白色或类白色的结晶或结晶性粉末，在乙醇或氯仿中略溶，在乙醚中极微溶，在水中不溶，常制成片剂。地塞米松磷酸钠为白色或微黄色粉末，在水中或甲醇中溶解，在丙酮、乙醚中几乎不溶，常制备为注射剂。地塞米松的药理作用主要是抗炎、抗过敏、免疫抑制和抗休克，在兽医临床上广泛应用于治疗母畜代谢病，或与抗生素联合用于治疗感染性疾病。由于其能提高饲料的转化率，促进畜禽生长，因此也用于畜牧生产[1-2]。然而，如果在动物生长过程中过量或不正确使用该药，会导致动物出现水肿、低血钾、肌肉萎缩、幼畜生长停滞和骨质疏松等症状；同时还会导致其在动物可食性组织中残留。尽管这类药物残留很低，但如果长期食用地塞米松残留超标食品，会引起人体激素代谢紊乱、肥胖、致畸或致癌等，产生蓄积性毒性、生态毒性，对人体健康和生态环境都会产生危害[3-5]。

1 地塞米松残留限量规定

由于用药安全意识淡薄和经济利益的驱使，养殖过程中不遵守休药期或过量使用地塞米松的现象时有存在。为规范该药物的使用、确保动物源性食品的质量安全以及保证消费者的健康，有必要对动物源性食品中地塞米松的残留加强管理。很多国家都严格禁止将地塞米松作为动物的生长激素进行使用，同时限制其用于动物源性食品中，并提出了严格的限量要求（表1）[6-7]。

表1 不同组织和国家对动物源性食品中地塞米松的最大残留限量规定

2 地塞米松残留检测技术

2.1 仪器分析法

2.1.1 气相色谱法

气相色谱（Gas Chromatography，GC）是一种以气体为流动相的色谱法，气体流动相称为载气，注入进样口的物质或其衍生物被加热气化后，由载气带入色谱柱进行分离，先后被检测器检出。气相色谱一般适用于分析分子量不大、有一定挥发性、在气化或高温下不分解的物质，若分子量大可以通过各种处理衍生为易挥发的化合物进行测定。

糖皮质激素挥发性不够，应用气相色谱技术检测时通常需要进行适当的衍生化反应，所以样品的前处理相对比较麻烦。早期用于检测糖皮质激素的气相色谱分析方法使用的是OV-17 柱，检测的是糖皮质激素的三甲基硅烷的衍生物[8]。气相色谱的灵敏度可以基本达到兽药残留的要求，但不适合痕量兽药残留分析的要求。

2.1.2 高效液相色谱法

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是目前应用广泛的一种分离分析技术，采用高压输液泵将规定的流动相泵装入有固定相的色谱柱中，柱内各成分在两相中分配系数存在微小差异而被分离，通过检测器实现对样品的分析。该方法适合不挥发性化合物、极性化合物和热不稳定化合物的分析测定。糖皮质激素的检测通常选用配有紫外检测器的液相色谱仪，可以提供比较满意的选择性和灵敏度。

20 世纪90 年代初，研究人员用正相和反相色谱法检测牛肉中的地塞米松，此后用于检测糖皮质激素的正相和反相色谱技术得到迅速发展[9-10]。2007年我国农业部发布了高效液相色谱法检测猪可食性组织中地塞米松残留的标准[11]。周佳等[12]建立了同时检测畜禽肉中地塞米松和呋喃唑酮残留的高效液相色谱法，该方法分离效果良好，平均回收率为85.41%～95.20%，最低检出限达1.0 ～2.0 µg/mL。与气相色谱技术相比，高效液相色谱不需要对样品进行衍生化，易于操作；但由于糖皮质激素的种类较多且分子结构相似程度大，导致在用该法检测时存在地塞米松和其他糖皮质激素分离度欠佳的问题[6,13]。

2.1.3 气相色谱-质谱联用法

气相色谱-质谱联用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）是将GC 和MS 通过接口连接起来，GC 将复杂混合物分离成单组分后进入MS。MS 是在电场和磁场中将运动的离子，如带电荷的原子、分子或分子碎片等，按它们的质荷比分离后进行检测的方法。色谱法不能对分析物进行准确定性及结构鉴定，而与质谱法联用能很好地解决这些问题。随着色谱与质谱联用技术的出现，许多研究者开始使用GC-MS 对尿样、血液、动物源性食品中的甾体激素残留进行测定与分析，并且具有较高的灵敏度。但是，MCLAUGHLIN 等[9]在用GC-MS 测定牛肝脏和肌肉组织中的地塞米松前，对待测物进行三甲基硅烷-烯醇-三甲基硅烷衍生化，处理相对较烦琐。

2.1.4 液相色谱与质谱联用法

液相色谱与质谱在液相色谱中被分离，离子化后经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。该方法有液相色谱-质谱联用 法（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）和 液 相 色 谱- 串 联 质 谱 法（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LCMS/MS），LC-MS/MS 相比LC-MS 能提供更多的质谱信号，有更高的选择性和灵敏度，对复杂样品基质中痕量组分的定性、定量分析具有独特的优势，是分析糖皮质激素的主要方法[2,6,14-15]。

使用液质联用技术能将糖皮质激素中互为差向异构体的地塞米松和倍他米松进行有效区分。DRAISCI 等[16]采用加速溶剂萃取法快速提取牛肝脏中的倍他米松和地塞米松，通过LC-MS 检测了这两种物质，肝组织中的倍他米松和地塞米松的最低定量限可达1 µg/kg，回收率为74%～77%。ANTIGNAC 等[17]用C18固相萃取柱浓缩和净化样品，用LC-MS/MS 检测了牛肉、尿、毛发中的倍他米松和地塞米松等12 种糖皮质激素残留，其中肉和尿中的激素残留最低检测限为0.04 ～0.07 μg/kg，毛发中的激素残留最低检测限为2.9 ～9.3 μg/kg，回收率为32%～67%。候亚莉等[18]将牛肉样品在碱性条件下经乙酸乙酯提取，正己烷脱脂，通过MCX 固相萃取小柱净化，采用LC-MS/MS测定地塞米松、倍他米松、倍氯米松药物残留，检出限和定量限分别为0.5 μg/kg和2.0 μg/kg，回收率在77.6%～97.9%。

对于牛奶中地塞米松的残留检测，因其中含有较多的蛋白质、脂肪，目标化合物含量低，易对检测造成干扰，因此前处理比较关键。任宏彬等[19]在用LC-MS 测定牛奶中地塞米松时，采用固相萃取法处理样品并优化色谱条件，方法的检出限和定量限分别为0.08 μg/kg 和0.25 μg/kg，回收率为65.7%～85.7%。陈妍等[20]建立了一种快速测定牛奶中地塞米松残留的LC-MS/MS 方法，检出限为0.19 μg/kg，回收率为85%～107.2%，检出限低于GB/T 22978—2008 中牛奶中地塞米松残留量的测定[21]。该法采用乙腈提取，正己烷液液萃取，不需要采用固相萃取柱，大大简化了提取净化的过程，缩短了检测时间，可用于牛奶中地塞米松残留量的初步筛查。目前，检测畜禽和牛奶中地塞米松和氯丙嗪均为单独检测或与其他同类物质同时检测，张燕等[22]开发了同时测定畜禽肉和牛奶中这两种药物残留的方法。样品经乙腈提取，C18固相分散萃取净化，通过LC-MS/MS 测定猪肉、牛肉、鸡肉和牛奶中地塞米松及氯丙嗪，方法的检出限为0.1 μg/kg，定量限为0.3 μg/kg，回收率为70.1%～119.4%。

2.1.5 超高效液相色谱-串联质谱法

超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS），借助了液相色谱的理论及原理，基于小颗粒高性能微粒作为固定相，与传统的HPLC技术相比提供了更高的效率，具有更强的分离能力。该方法分离能力高效、选择性高、灵敏度高，在近些年的兽药残留分析中经常被研究和应用。

基于此方法，有研究者开发出同时检测一种动物源性食品中多种兽药残留的方法或检测不同动物源食品中的地塞米松残留的方法。仲伶俐等[23]将牛奶样品通过乙腈提取后，采用Oasis PRiME HLB 固相萃取小柱净化，建立了同时测定牛奶中地塞米松、替米考星、氟苯尼考和氯霉素药物残留的UPLCMS/MS，方法的检测限达0.1 ～0.2 µg/kg，定量限为0.2 ～0.5 µg/kg，平均回收率为78.6%～94.7%。陈少莉等[24]在农业部发布的LC-MS 检测动物源性食品中糖皮质激素类药物多残留方法的基础上，对测定条件进行优化，开发了UPLC-MS/MS 测定猪、牛肉、鸡蛋和牛奶中的地塞米松，平均回收率在83.2%～108.2%，最低定量限在0.2 ～1.0 µg/kg[25]。杨毅青等[26]分别将牛奶、鸡蛋样品经乙酸-乙酸钠和甲醇溶液处理，通过两种固相萃取柱串联净化样品，使用UPLC-MS/MS 测定不同基质中地塞米松残留量，平均回收率为70.53%～118.25%，RSD 为3.5%～7%。曹丽丽等[27]采用QuEChERS 前处理，将不同动物源性基质进行净化后用UPLC-MS/MS 测定多种动物源性食品中的地塞米松残留，检出限为0.1 µg/kg，平均回收率为73.2%～95.9%。

2.2 免疫分析法

2.2.1 免疫层析法

免 疫 层 析 法（immunochromatography assay，ICA）是20 世纪末发展起来的一种结合了免疫技术和色谱层析技术的检测方法，是基于抗原抗体特性免疫反应的一种新型膜检测技术。在层析过程中，标记了胶体金或荧光物质的抗体与样本中的待检测物质结合形成复合物，通过毛细作用力在试纸条上层析，并被硝酸纤维素膜上的特异性抗体或抗原捕获而富集，根据肉眼或仪器对条带上的标记物进行观察或检测来实现定性或定量检测。目前研究应用的热点主要是胶体金免疫层析、荧光免疫层析和磁珠免疫层析[28]。免疫层析检测技术具有单人份检测、对操作者要求低、检测快速和成本低等优点，是免疫检测方法中的常见技术。近年来，随着地塞米松半抗原及抗体的开发，越来越多的研究者开发了基于免疫层析原理的地塞米松快速检测方法。

WANG 等[29]制备了基于地塞米松琥珀酸酐衍生物半抗原的抗地塞米松单克隆抗体，该抗体对地塞米松具有高特异性，抗体的半抑制浓度（IC50）为0.095 ng/mL，并以此为基础开发了用于检测牛奶中地塞米松残留的免疫层析胶体金试纸条，在牛奶样品中的视觉临界值（cutoff 值）为0.5 ng/mL，每次检测仅需10 min。ZHANG 等[30]开发了基于上转换发光微球的免疫层析检测方法，用于快速、定量检测动物组织中的地塞米松，IC50为0.58 ng/mL，检出限为0.3 µg/kg，平均回收率达84.5%，同时配套了手持读取仪进行现场定量，可在10 min 内读取结果。LI 等[31]将胶乳颗粒应用于免疫层析，实现了牛奶和猪肉中地塞米松的定量检测，15 min 内完成检测，肉眼判读的检出限分别为0.3 µg/L 和0.7 µg/kg，定量限分别为0.047 µg/L 和0.087 µg/kg，回收率为80.0%～122.8%。在此基础上，LI 等[32]又开发了基于时间分辨荧光微球的地塞米松免疫层析检测方法，配套手持式荧光读取仪可定量检测牛奶和猪肉中的地塞米松，cutoff 值分别为0.25 µg/L 和0.7 µg/kg，定量限分别达到0.003 µg/L 和0.062 µg/kg，检测结果与LC-MS/MS 检测结果基本一致。

免疫检测技术已经广泛应用于人类医学、动物医学、食品安全和环境卫生的检验。早期的免疫层析技术主要利用胶体金显色原理进行定性检测，近10 年来，随着荧光材料（包括荧光染料、普通荧光微球、时间分辨微球和上转发光微球等各种微球）和超顺磁性纳米微球新型标记物及检测仪的开发，基于免疫层析平台的定量检测产品已经实现了产业化。

2.2.2 酶联免疫法

酶联免疫法（Enzyme-Linked Immune Sorbent Assay，ELISA）是将抗原或抗体结合至某种固相载体表面，并保持其免疫活性，将抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体，加入待测定样品，使其与被吸附的抗原或抗体及后加入的酶标二抗之间发生免疫反应，最后加入酶反应底物，终止反应，根据显色反应所产生颜色的深浅用分光光度计进行定性或定量分析。该方法具有灵敏度高、特异性强、分析时间短、样品检测成本低和复杂样品预处理简单的特点，适合于批量样品的定性初筛工作。ELISA法的类型有间接法、双抗体夹心法、竞争法。前两种方法用于测定抗体和大分子抗原，应用于临床诊断；竞争法按实验步骤的不同又可分为直接竞争法和间接竞争法，适合测定小分子抗原，尤其适用于食品安全检测领域[33-34]。

早在1998 年CERNI 等[35]开发了一种快速简单的提取方法，并通过酶联免疫法测定牛肝中地塞米松，回收率为92%～154%，检出限和定量限分别 为1.43 µg/kg 和2.09 µg/kg。KOLANOVIĆ[36]对Euro-Proxima B.V.公司的皮质类固醇酶联免疫试剂盒性能进行了验证，此试剂盒可检测奶、肝脏、尿液等样本中的地塞米松等皮质类固醇，其中牛奶和肝脏中地塞米松的检出限分别为0.2 µg/kg 和0.6 µg/kg，定量限分别为0.3 µg/kg 和1.4 µg/kg，回收率为68%～131%。VDOVENKO 等[37]开发了一种基于过氧化物酶检测牛奶中地塞米松的化学发光酶联免疫检测方法。通过对牛奶添加25%的甲醇并进行离心，防止了牛奶的基质效应。检测的IC50为0.9 ng/mL，检测的变异系数为2.2%～9.9%，回收率在82%～142%。罗晓琴等[7]建立的间接竞争ELISA 法对鸡肉样本的最低检测限为0.1 µg/kg，变异系数为9.0%～12.2%，该方法的样本前处理简单、灵敏度高、准确度和精密度可满足兽药残留检测要求。WANG 等[38]制备了地塞米松半抗原和多克隆抗体，并建立了间接竞争酶联免疫吸附试验，检测鸡组织中的地塞米松，IC50为0.061 ng/mL，检出限为0.015 µg/mL，回收率为83.3%～114.2%，变异系数为5.6%～9.5%；鸡肉和鸡肝中地塞米松的检出限分别为0.3 µg/kg 和0.5 µg/kg，具有灵敏度高、精密性好的特点，不足之处在于抗体对地塞米松的结构类似物有交叉反应，特异性欠缺。采用间接竞争ELISA法检测地塞米松残留，具有精确度和灵敏度较高、操作技术要求低、检测时间短和检测样本量大等特点，适合于大量样本中地塞米松残留检测的快速筛选，已成为目前用于畜禽组织中兽药残留检测的常用方法。

3 结语

GC、GC-MS 检测地塞米松残留都需要对样品进行衍生化，样品的前处理比较烦琐，目前应用不多。随着联用技术的发展，液质联用技术在地塞米松残留检测中应用较多，LC-MS、LC-MS/MS、UPLCMS/MS 将色谱对复杂样品的高分离能力与质谱的高选择性、高灵敏度以及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，提高了样品分析工作效率，目前在药物分析、食品分析、环境分析等领域应用广泛。在法定的动物源性食品中糖皮质激素残留检测、地塞米松残留检测多采用该类方法。因动物源性食品中地塞米松的残留水平较低，其属于糖皮质激素，内源性的干扰物质较多，基质复杂难分离，会干扰实验结果、污染仪器，所以在测定前会采用各种净化处理方式对样品基质进行处理，如采用正己烷脱脂法、固相萃取法、QuEChERS 前处理，以达到对检测物富集和便于测定的目的。仪器测定方法结果准确、灵敏度较好，但样品前处理复杂、仪器昂贵、需专业人员操作且检测时间长，由于检测成本、检测周期和人员要求的原因限制了其在基层的推广及现场的高通量检测。

目前地塞米松的免疫检测方法主要是免疫层析和酶联免疫，胶体金免疫层析法操作简单、使用方便，适合检测机构、监督部门、生产企业的现场快速检测，属于定性检测方法，缺点是灵敏度欠佳。酶联免疫分析法具有通量大、灵敏度高、特异性强和成本较低的特点，但操作过程需要专业人员操作，耗时较长、操作较烦琐，且需要样本积累到一定的数量，否则容易造成浪费，比较适用于中心实验室的检验。近些年，随着生物技术的发展和人们对食品安全的关注，地塞米松免疫检测的原料及成品试剂盒也越来越成熟。理论上而言，只要制备了地塞米松的半抗原和抗体，就可以开发各种包括免疫层析、酶联免疫、免疫荧光等在内的免疫检测方法。对于免疫层析而言，由于近年来出现了各种标记物，有望提高检测的灵敏度，但传统的胶体金或微球免疫荧光已能满足各国对食品中地塞米松的检出要求，所以将来的发展方向可能是进一步简化各种样本的前处理，使检测方法更加简单、快速。对于酶联免疫检测这种传统的免疫检测方法而言，因为灵敏度足够高，可能更侧重于提高检测的特异性，以防止检测过程中出现假阳性的情况。

兽药残留是影响动物源性食品安全的一个重要因素，检测技术是保障食品安全的技术支撑，通过对地塞米松残留检测研究技术的综述，以期为食品中该药物的残留检测相关研究和安全监管提供参考。同时，仍需要主管部门完善法律体系，从养殖的源头控制和规范使用兽药，遵守休药期，多方面确保食品质量安全和人们的健康。