液相色谱-质谱法测定猪肉中禁用兽药五氯酚酸钠测量不确定度评定

杨 柳，许瑞清，崔小芳，刘建春

（1.山西省检验检测中心，山西太原 030032；2.山西锦烁生物医药科技有限公司，山西晋中 030600）

五氯酚酸钠即五氯酚钠，可用作落叶树休眠期喷射剂，以防治褐腐病，也用作除草或杀虫剂[1]。中华人民共和国农业农村部第250 号公告将五氯酚酸钠列入食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Thermo U3000-AB seicx 4500Qtrap 液相色谱质谱联用仪，赛默飞世尔科技有限公司；P-SAX 固相萃取柱（60 mg/3 mL），月旭科技(上海)股份有限公司；UW620H 电子天平，日本岛津公司。

五氯酚酸钠标准溶液（1 000 μg/mL，由坛墨质检标准物质中心提供）；乙腈、甲醇均为质谱级。

采用GB 23200.92—2016[2]进行测量。由同一检验员在相近的时间内，对同一份猪肉样品测定10 次，对测量结果评定测量不确定度。

1.2 检测方法

称取均质试样2 g，置于10 mL 聚丙烯离心管中，加入6 mL 5%三乙胺的乙腈-水溶液，均质提取2 min。3 000 r/min 离心5 min，收集上清液于离心管中。重复上述提取步骤1 次，合并上清液，混匀。将提取溶液转入经过预处理的MAX 固相萃取柱中，1 滴/s 流速使样液全部通过固相萃取柱，弃去流出液。依次用5 mL 5%氨水溶液、5 mL 甲醇、5 mL 2%甲酸的甲醇-水溶液淋洗，弃去流出液，抽干固相萃取柱5 min 以上。以4 mL 4%甲酸甲醇溶液洗脱，洗脱液收集于10 mL 具刻度试管，40 ℃水浴下氮吹至1 mL，用水定容至2 mL，混匀。过0.22 μm 滤膜，供测定。

1.3 标准溶液配制

采用吸取标准溶液0.1 mL 定容至10 mL 容量瓶中的方法，2 级稀释配制成10 ng/mL 的五氯酚酸钠中间使用液，依次吸取相应体积置于10 mL容量瓶中，用基质液定容，配成0 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL 和5.0 ng/mL 的标准工作系列。

1.4 仪器条件

（1）色谱条件。SHISEIDO CAPCELL PAK MG III C18（150 mm×2.0 mm，5μm）色谱柱；流动相：甲醇+5 mmol/L 乙酸铵溶液（60+40），等度洗脱；流速：300 μL/min；柱温：40 ℃；进样量：1 μL。

（2）质谱条件。离子化模式：电喷雾电离负离子模式（ESI-）；质谱扫描方式：多反应监测（MRM）；定量离子对：262.7 ＞262.7，定性离子对：264.7 ＞264.7、266.7 ＞266.7、268.7 ＞268.7。

1.5 测量过程

用液相色谱质谱仪测定工作标准系列溶液的峰面积，制作标准工作曲线。待测样液注入仪器测定，用标准工作曲线定量，得出样液浓度。

2 测量结果分析

2.1 建立测量数学模型

根据测量过程建立测量数学模型：

式中：xi为试样中待测物含量，μg/kg；ci为样液中待测物的浓度，ng/mL；V为试样经处理后定容体积，mL；m1为试样的质量，g。

2.2 重复性测量结果

在相近的时间内，由同一操作人员对样品测量，10 次 测 定 结 果 分 别 为0.210 μg/kg、0.188 μg/kg、0.186 μg/kg、0.200 μg/kg、0.203 μg/kg、0.199 μg/kg、0.190 μg/kg、0.208 μg/kg、0.203 μg/kg 和0.184 μg/kg，平均值x—=0.197 μg/kg，标准偏差s=0.009 39。

3 测量不确定度评定

3.1 测量重复性引入的测量不确定分量

3.2 工作曲线变动性的不确定度分量

标准工作系列溶液分别进行3 次重复测定，数据处理见表1。

根据表1 中的测试数据，用最小二乘法拟合线性回归方程，标准工作曲线方程：y=356 880x+44 868，b=356 880，a=44 868，R=0.998 5。由工作曲线变动性引起被测量溶液浓度标准不确定度为：

表1 标准工作曲线测量参数

式中：n为标准工作曲线测量次数，n=18；P为样品溶液测量次数为工作曲线各校准浓度的平均值

被测样品平均含量为0.197 μg/kg，根据标准工作曲线待测物浓度为则标准不确定度为u(c)1=0.961，相对标准不确定度为

3.3 标准储备液浓度的不确定度分量

五氯酚酸钠标准储备液标准物质证书（编号91098b，唯一标识21090491）给出相对扩展不确定度为U=kurel(c)=0.02（k=2），因此urel(c)2=0.01。

3.4 定容体积引起的不确定度分量

10 mL 离心管定容至2 mL，依据JJG 10—2005[3]其允许误差为±0.2 mL，其允差不确定度按均匀分布计算为不考虑过程中由温差引起的不确定度。其标准不确定度为u(V)=0.115，相对标准不确定度为

3.5 取样量引入的不确定度分量

3.6 合成不确定度

上述各分量互不相关，按照不确定度传播率公式计算相对合成不确定度

标 准 合 成 不 确 定 度 为u(x—) =0.197×0.665=0.131 μg/kg。

3.7 扩展不确定度

取95%置信概率，包含因子k=2，扩展不确定度U=ku=2×0.147=0.262 μg/kg。

4 测量不确定度报告

用液相质谱法测定猪肉试样中五氯酚酸钠测量不确定度报告为x=0.197[-0.065,0.459] μg/kg，k=2。采用经典方法调整，用液相质谱法测定猪肉试样中五氯酚酸钠测量不确定度报告为x=0.197[0,0.491] μg/kg，k=2。

5 结论与讨论

禁用药物是常见食品检测项目，其测量值低，接近于零，即使为负数也是合理的，可以按照GUM 法对测量不确定度进行评定，报告时对报告值加以修正，本研究采用经典方法加以修正[3-4]。

5.1 经典方法确定扩展不确定度区间

经典方法直接将扩展不确定度区间从零开始调整，这样测量不确定度则为不对称区间，如图1 中（d）[5]。测量值低于0 时，将测量值与测量区间同时调整，如图1 中（b）（c）。图1 中（a）则调整为0[0,0]，k=2。

图1 经典方法接近于零的扩展不确定度区间情况

5.2 各分量测量不确定度分析

评定中各相对标准不确定度分量说明：A 类评定为测量重复性、工作曲线变动性；B 类评定为标准储备液、定容体积和取样量。本研究所建立的测量评定方法，工作曲线变动性引入测量不确定度贡献最大，贡献率为88.88%。