基于UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn和分子网络技术快速鉴定灯盏细辛注射液的化学成分

张雨婷，王春国，邓欣祺，闫兴丽，刘窈玉，兰 宇，王宇航，王家平，金重先，石晋丽，张硕峰

(1.北京中医药大学，北京中医药研究院，北京 102488；2.北京中医药大学中药学院，北京 102488；3.北京中医药大学生命科学学院，北京 102488；4.北京中医药大学中医学院，北京 102488)

灯盏细辛注射液是灯盏细辛经提取精炼而成的灭菌水溶液，具有活血祛瘀、通络止痛之功效[1]，在临床上用于治疗缺血性中风、冠心病、心绞痛等疾病[2-6]。现代药理学研究表明，灯盏细辛注射液具有舒张血管，改善微循环，提高心脑供血；调节血脂，降低血液黏稠度，改善血液流变性；抑制血小板及红细胞聚集，促进纤溶活性；清除氧自由基，对抗脂质过氧化及缺血再灌注损伤等药理作用[7-17]。

灯盏细辛化学成分研究始于20世纪70年代，目前，已从灯盏细辛药材中检测到80余种化学成分，其中黄酮类和咖啡酰酯类化合物是灯盏细辛注射液的主要化学成分[15-25]。但是，关于灯盏细辛注射液的化学成分尚缺乏系统研究。有报道使用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)[26-27]对灯盏细辛注射液中的主要化学成分进行定性和定量测定，由于DAD对化合物结构信息表征的有限性以及灵敏度的不足，无法实现标准品以外的化合物结构鉴定。Zhou等[28]建立了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法同时测定灯盏细辛注射液中9种主要生物活性成分；Wang等[23]建立了LC-DAD-ESI-MSn快速定性分析的方法，成功鉴定了灯盏细辛注射液中18种化合物；Zhang等[29]采用Q-TOF MS对灯盏细辛注射液进行快速分析，共鉴定了44种化合物，其中15种为首次报道。上述研究多采用低分辨质谱或TOF质谱，且化合物鉴定的数量和深度有待提高，而基于Orbitrap质谱对灯盏细辛注射液的研究尚未见报道。

线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱(LTQ-Orbitrap MS)是将线性离子阱质谱和高分辨质谱结合的杂交型质谱仪，具有离子阱质谱的多级碎裂、Orbitrap的高质量分辨能力和精确质量数的优势，有助于定性分析复杂成分体系[30-31]。全球自然产物社会分子网络(GNPS)是由 Watrous等[32]基于相关化合物的MS/MS碎片模式相似性创建的分子网络，并率先应用到微生物天然产物研究中。目前，GNPS已经收录了22 644个化合物和235 850个谱图，其中分子网络是GNPS平台中主要的分析工具之一，通过计算MS/MS的相似性关系来创建结构化的数据表，以反映串联质谱实验中捕获的分子多样性。程桃芳等[33]综述了基于GNPS的分子网络技术在中药中的应用进展。该技术已经广泛应用于中药化学成分的定性表征、定量表征、质量控制以及中药活性成分的分离制备等方面。

本研究拟采用UHPLC-LTQ-Orbitrap MSn和分子网络技术对灯盏细辛注射液成分进行快速筛查和深度鉴定，并解析其可能存在的新成分，以形成一套较为完整的成分表征策略。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

LTQ-Oribitrap XL线性离子阱-串联静电场轨道阱质谱仪：美国Thermo Scientific公司产品，配有热喷雾离子源(HESI)、Xcalibur 2.1化学工作站；DionexUtimate 3000 UHPLC Plus Focused超高效液相色谱系统：美国Thermo Scientific公司产品，含二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器；Millipore Synergy UV型超纯水机：美国Millipore公司产品；Sartorious BT 25S型万分之一电子分析天平：北京赛多利斯仪器有限公司产品。

1.2 主要材料与试剂

灯盏细辛注射液(批号Z53021569)：云南生物谷药业股份有限公司产品；绿原酸、新绿原酸、飞蓬酯乙、野黄芩素和野黄芩苷等标准品：成都瑞芬思生物科技公司产品；0.22 μm微孔滤膜：天津市津腾实验设备有限公司产品；甲酸、甲醇、乙腈等试剂：均为质谱纯，美国Fisher公司产品。

1.3 实验条件

1.3.1色谱条件 色谱柱：AQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)；流动相：0.1%甲酸水溶液(A)，乙腈溶液(B)；梯度洗脱条件：0～3 min(5%B)，3～45 min(5%～75%B)，45～45.1 min(75～5%B)，45.1～50 min(5%B)；流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL；柱温：35 ℃。

1.3.2质谱条件 正离子检测模式：HESI离子源，温度350 ℃，电离源电压4 kV，毛细管电压35 V，管透镜电压110 V，鞘气和辅助气均为高纯氮气(纯度>99.99%)，鞘气压力2.76×105Pa，辅助气流速6.67 L/min；负离子检测模式：HESI离子源，温度350 ℃，电离源电压3 kV，毛细管电压35 V，管透镜电压110 V，鞘气和辅助气均为高纯氮气(纯度>99.99%)，鞘气压力2.07×105Pa，辅助气流速3.34 L/min。

正、负离子数据采集均使用傅里叶变换高分辨全扫描方式(TF,Full scan,分辨率30 000)数据依赖性(data-dependent acquisistion)ddMS3，运用碰撞诱导解离(CID)碎裂方式。

1.4 标准品溶液制备

精密称取适量的绿原酸、新绿原酸、飞蓬酯乙、野黄芩素和野黄芩苷，配制成250 mg/L标准品溶液。

1.5 样品溶液制备

取适量的灯盏细辛注射液，过0.22 μm微孔滤膜，待测。

2 结果与讨论

2.1 标准品的质谱裂解行为

2.1.1咖啡酰酯类化合物 灯盏细辛注射液中咖啡酰酯类化合物主要包含咖啡酰-奎宁酸(CQA)、咖啡酰-2,7-脱氢-3-脱氧-2-辛酮糖酸(caffeoyl-2,7-anhydro-3-deoxy-2-octulopyranosonic acid,CDOA)、咖啡酰-2,7-脱氢-2-辛酮糖酸(caffeoyl-2,7-anhydro-2-octulosonic acid,COA)和咖啡酰-1-(2′-γ-吡喃酮，CPO)4类化合物，示于图1。本文选取灯盏细辛CQA类代表化合物绿原酸和新绿原酸，CDOA类代表化合物飞蓬酯乙进行质谱裂解行为分析。

图1 灯盏细辛中4种咖啡酰酯衍生物母核Fig.1 Cores of caffeoyl ester derivatives identified in Erigeron breviscapus

绿原酸和新绿原酸均为1分子咖啡酸(caffeic acid)和1分子奎宁酸(quinic acid)形成的单咖啡酰酯类化合物。在CID裂解下，由于酯键的存在，2种化合物均会碎裂形成m/z191[M-Caffeoyl-H]-和m/z179 [Caffeic acid-H]-特征碎片离子，其中m/z191进一步碎裂形成m/z173[M-Caffeoyl-H2O-H]-碎片离子。由于绿原酸和新绿原酸是咖啡酰基在奎宁酸母核5位和3位的同分异构体，所以两个化合物的MS2和MS3碎片种类基本一致，示于图2a、2b，主要区别是m/z191和m/z173丰度的大小，即绿原酸以m/z191为基峰，而新绿原酸以m/z173为基峰。

飞蓬酯乙为单咖啡酰-2,7-脱氢-3-脱氧-2-辛酮糖酸衍生物，在MS2中，咖啡酰酯键以不同形式断裂生成m/z381 [M-Caffeoyl-H]-和m/z179 [Caffeic acid-H]-碎片离子。其中，m/z381为基峰，进一步CID碎裂，在MS3中连续中性丢失形成m/z363、337、293等碎片离子，并在谱图的低分子质量端形成m/z179 [Caffeic acid-H]-和m/z161 [Caffeic acid-H2O-H]-等碎片离子。

综上，咖啡酰酯类化合物的质谱碎裂规律主要围绕酯键断裂形成[M-Caffeoyl-H]-的母核碎片(如m/z191、381等)和[Caffeic acid-H]-的咖啡酸碎片为主。

注：a.绿原酸；b.新绿原酸；c.飞蓬酯乙图2 主要咖啡酰酯类标准品MS2和MS3谱图及碎裂途径Fig.2 MS2,MS3 spectra and fragmentation pathways of major caffeoyl ester standards

2.1.2黄酮类化合物 4′,5,6,7-四羟基黄酮(野黄芩素)是灯盏细辛中重要的黄酮类母核，其糖苷键化合物野黄芩苷是灯盏细辛中含量最高的黄酮。

野黄芩苷经CID裂解后，糖苷键碎裂，丢失1分子葡萄糖醛酸，形成4′,5,6,7-四羟基黄酮苷元，因此，野黄芩苷MS3与野黄芩素MS2的碎片基本一致，示于图3a、3b。研究野黄芩素的MS2和MS3质谱裂解行为发现，野黄芩素主要以发生RDA1,3裂解和中性丢失为主，形成m/z119、169、267、241、239、211、213、185等碎片离子。

注：a.野黄芩苷；b.野黄芩素图3 主要黄酮类标准品MS2和MS3谱图及碎裂途径Fig.3 MS2,MS3 spectra and fragmentation pathways of major flavonoids standards

2.2 基于MS/MS关联的分子网络分析灯盏细辛注射液成分类别

在总结咖啡酰酯类(绿原酸、异绿原酸和飞蓬酯乙)和黄酮类(野黄芩素和野黄芩苷)标准品质谱裂解规律的基础上，进一步运用基于MS/MS关联的分子网络技术分析灯盏细辛注射液成分。分别使用绿原酸、异绿原酸、飞蓬酯乙、野黄芩素和野黄芩苷等标准品作为“种子”节点，基于MS/MS碎裂模式的相似性，发现灯盏细辛主要成分被聚为多个类别，其中与“种子”节点绿原酸、异绿原酸、飞蓬酯乙相关的成分被标记为粉红色，与“种子”节点野黄芩素和野黄芩苷相关的成分被标记为绿色，示于图4。基于MS/MS碎片及与“种子节点“的质量差异进行注释，主要簇被注释为单咖啡酰奎宁酸(monoCQAs)、双咖啡酰奎宁酸(diCQAs)、三咖啡酰奎宁酸(triCQAs)、单咖啡酰-2,7-脱氢-3-脱氧-2-辛酮糖酸(monoCDOAs)、双咖啡酰-2,7-脱氢-3-脱氧-2-辛酮糖酸(diCDOAs)、三咖啡酰-2,7-脱氢-3-脱氧-2-辛酮糖酸(triCDOAs)以及黄酮类。

图4 基于MS/MS关联的灯盏细辛注射液分子网络图Fig.4 Molecular network analysis based on MS/MS association in Erigeron breviscapus injection

2.3 灯盏细辛注射液中咖啡酰酯类化合物鉴定

2.3.1单咖啡酰酯类化合物鉴定

1) 单咖啡酰奎宁酸以及衍生物

根据高分辨质谱精确分子质量(质量误差≤5×10-6)的提取离子色谱(extracted ion chromatography,XIC)图发现，与对照品绿原酸和新绿原酸元素组成(C16H18O9)一致的化合物共有8个，示于图5a。其中，峰1～7具有MS/MS信息，其碎片离子均出现m/z191、179、173等咖啡酰和奎宁酸的特征碎片，由此推断为单咖啡酰-奎宁酸类化合物；根据对照品绿原酸和新绿原酸，以及文献保留时间[23,34-38]和MS/MS碎片，鉴定峰4～7分别为1-CQA、3-CQA、5-CQA、4-CQA，而峰1～3为从该植物中首次鉴定。

图5 灯盏细辛中单咖啡酰酯类化合物的提取离子色谱图Fig.5 Extracted ion chromatograms of monocaffeoyl ester compounds in Erigeron breviscapus

峰12(图5c)和17(图5e)的精确分子质量分别为335.076 41、367.102 96，推测其元素组成为C16H15O8(质量误差1.13×10-6)和C17H19O9(质量误差1.33×10-6)。在MS/MS中，峰12主要以m/z161、135等咖啡酸特征碎片为主；峰17主要以m/z193等咖啡酸甲酯碎片为主。结合文献[23,36-41]，推测峰12为3-O-咖啡酰-γ-奎尼内酯，峰17为5-O-咖啡酰基奎宁酸甲酯。

2) 单咖啡酰-2,7-脱氢-3-脱氧-2-辛酮糖酸以及衍生物

峰8～11(图5b)的精确分子质量为381.082 06，推测其元素组成为C17H17O10(质量误差分别为1.71×10-6、1.68×10-6、1.70×10-6、2.02×10-6)，在MS2中的碎片离子与飞蓬乙酯在MS3中的碎片离子基本一致，均含有m/z363、337、293、251、179、161等碎片离子，由此推断峰8～11为单咖啡酰-2,7-脱氢-3-脱氧-2-辛酮糖酸及其同分异构体。根据文献[34,38-39]及保留时间等信息，推测峰8～11分别为3-CDOA、4-CDOA、6-CDOA、9-CDOA，其中6-CDOA为从灯盏细辛及其注射液中首次鉴定。

3) 单咖啡酰-2,7-脱氢-2-辛酮糖酸及其衍生物

峰13～16(图5d)的精确分子质量为397.076 93，推测其元素组成为C17H17O11(质量误差分别为1.76×10-6、1.51×10-6、1.76×10-6、2.01×10-6)，MS2中的主要碎片离子为m/z335、293、235、179、161、135等。其中，m/z179、161、135等为咖啡酸特征碎片，推测峰13～16为咖啡酰衍生物。峰13～16的准分子离子与峰8～11相差16 u，碎片离子m/z335、235等与峰8～11的碎片离子m/z363、251等也相差16 u，由此推测化合物13～16为单咖啡酰-2,7-脱氢-2-辛酮糖酸及其同分异构体。根据文献[34,38-39,42]及保留时间等信息，推测峰13～16分别为2-COA、3-COA、4-COA、9-COA，其中3-COA为从灯盏细辛及其注射液中首次鉴定。

4) 咖啡酰-1-(2′-γ-吡喃酮)

峰18元素组成为C20H19O11(图5f)，根据文献[34,39,43]和MS/MS碎片，鉴定其结构为咖啡酰-1-(2′-γ-吡喃酮)灯盏花苷I(多舌飞蓬苷)。

2.3.2双咖啡酰奎宁酸类化合物鉴定

1) 双咖啡酰奎宁酸以及衍生物

峰19～22(图6a)的精确分子质量为515.118 31，推测其元素组成为C25H23O12(质量误差分别为2.29×10-6、2.15×10-6、1.92×10-6、2.31×10-6)，在MS2中的碎片离子以m/z353为基峰，进一步CID裂解，在MS3中的碎片离子与峰1～7的MS2碎片基本一致。根据峰19～22的准分子离子与峰1～7的准分子离子相差C9H6O3(1分子咖啡酰基)，推测峰19～22为diCQA及其同分异构体。根据文献[23,34,36-37,39,41]及保留时间等信息，推测峰19～22分别为1,3-diCQA、1,4-diCQA、3,4-diCQA、1,5-diCQA。

图6 灯盏细辛中双咖啡酰酯类化合物的提取离子色谱图Fig.6 Extracted ion chromatograms of dicaffeoyl ester compounds in Erigeron breviscapus

峰27～29(图6e)的精确分子质量为529.134 40，推测其元素组成为C26H25O12(质量误差分别为1.38×10-6、1.60×10-6、2.28×10-6)，与峰19～22相差14 u，由此推测峰27～29为diCQA的羟基甲基化结构。与峰19～22相似，峰27～29在MS2中的碎片离子以m/z353为基峰，进一步佐证了上述为diCQA羟基甲基化结构的推测，结合文献[36,41,44-45]及保留时间等信息，鉴定峰27～29分别为3,4-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯。同理，峰30(C27H26O13)(图6f)和峰31(C27H28O12)(图6g)分别为1-O-甲基-3,5-O-双咖啡酰基奎宁酸甲酯和飞蓬酯A(acetyl-diCQA)。

2) 双咖啡酰-2,7-脱氢-3-脱氧-2-辛酮糖酸以及衍生物

峰24(图6c)的精确分子质量为543.111 48，推测其元素组成为C26H23O13(质量误差-0.13×10-6)，其MS2和MS3与对照品飞蓬酯乙相同，鉴定峰24为飞蓬酯乙。峰32～34(图6h)的精确分子质量为705.167 08(质量误差分别为1.46×10-6、1.43×10-6、2.92×10-6)，推测其元素组成为C32H33O18，与飞蓬酯乙相差C6H6O6，由此推测峰32～34为diCDOA的葡萄糖苷，可能分别为3,9-diCDOA、3,4-diCDOA、4,9-diCDOA，其中3,9-diCDOA、3,4-diCDOA为从灯盏细辛和注射液中首次鉴定。

3) 双咖啡酰-2,7-脱氢-2-辛酮糖酸及其衍生物

峰25、26(图6d)的精确分子质量为559.107 69，推测其元素组成为C26H23O14(质量误差分别为2.15×10-6、2.33×10-6)，在MS2中的主要碎片离子为m/z397、381等，进一步CID裂解，在MS3中的碎片离子与峰13～16的MS2碎片基本一致。根据峰13～16的准分子离子与峰25、26的准分子离子相差C9H6O3(1分子咖啡酰基)，推测峰25、26为diCOA及其同分异构体。根据文献[34,38-39]及保留时间等信息，推测峰25、26分别为3,9-diCOA、4,9-diCOA。

2.3.3三咖啡酰奎宁酸类化合物鉴定 峰35～38(图7a)的精确分子质量为677.151 70，推测其元素组成为C34H29O15(质量误差分别为-0.75×10-6、0.43×10-6、1.46×10-6、-0.31×10-6)，在MS3中的碎片离子与峰19～22的MS2碎片基本一致。根据峰35～38的准分子离子与峰19～22的准分子离子相差C9H6O3(1分子咖啡酰基)，推测峰35～38为triCQA及其同分异构体。根据文献[34,38-39]及保留时间等信息，推测峰35～38分别为1,3,5-triCQA、1,4,5-triCQA、1,3,4-triCQA、3,4,5-triCQA。

图7 灯盏细辛中三咖啡酰酯类化合物的提取离子色谱图Fig.7 Extracted ion chromatograms of tricaffeoyl esters compounds in Erigeron breviscapus

峰39(图7b)的精确分子质量为705.146 39，推测其元素组成为C35H29O16(质量误差-0.41×10-6)，在MS3中的碎片离子与峰24的MS2碎片基本一致。根据峰39的准分子离子与峰24的准分子离子相差C9H6O3(1分子咖啡酰基)，推测峰39为triCDOA。根据文献[34,38]及保留时间等信息，推测峰39为3,4,9-triCDOA。

同理，鉴定峰40～44(图7c)为triCOA及其同分异构体。

2.4 灯盏细辛注射液中黄酮类化合物鉴定

在HESI负离子模式下，峰53的准分子离子峰为m/z301.035 11 [M-H]-，元素组成为C15H9O7(质量误差0.89×10-6)。在MS/MS中产生m/z273.04、257.04、229.05、179.00、151.00、107.01等碎片离子，示于图8a，其中碎片离子m/z151.00、179.00是黄酮类化合物RDA1,3A-裂解产生的互补离子；m/z273.04、257.04为黄酮C环裂解分别丢失CO和O形成的碎片离子。根据文献[46-47]，鉴定峰53为槲皮素，其质谱裂解途径示于图8b。

图8 槲皮素标准品的MS2谱图(a)和碎裂途径(b) Fig.8 MS2 spectrum (a) and fragmentation pathways (b) of quercetin standard

在灯盏细辛提取液中还鉴定到峰山柰酚(峰45)、木犀草素(峰46)、芹菜素(峰47)、槲皮素-3-O-β-半乳糖醛酸苷(峰61)、野黄芩苷(峰62)、5,6,4′-三羟基黄酮-7-O-β-D-半乳糖醛酸苷(峰63)、芹菜素-7-O-β-半乳糖醛酸苷(峰64)、4′-羟基黄芩素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(峰57)、黄芩素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(峰59)、芹菜素-7-葡萄糖苷(峰60)等黄酮类化合物。

在灯盏细辛注射液中共鉴定到84种化学成分，其中49种成分为灯盏细辛制剂中首次鉴定，具体信息列于附表1(请登录《质谱学报》官网http:∥www.jcmss.com.cn下载)。

3 结论

本研究针对中药注射液复杂的化学成分体系，采用简单的前处理方法，同时结合超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱和分子网络技术，建立了一种快速筛查和鉴定中药灯盏细辛注射液中化学成分的分析方法。该方法操作简单、重现性好、分辨率高，可实现对灯盏细辛注射液中84种化学成分的快速筛查。本研究进一步丰富和细化了灯盏细辛有效成分信息特征，可为灯盏细辛化学成分的分析提供参考，对灯盏细辛注射液的进一步研究和安全使用具有重要意义。