痰热清注射液特征图谱建立及4种成分测定

张静娴， 孙 健， 陈 军， 吴清臣， 毛秀红， 胡 青*， 季 申*

(1.上海市食品药品检验研究院，国家药品监督管理局中药质量控制重点实验室，上海 201203；2.上海凯宝药业股份有限公司，上海 200030)

痰热清注射液由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘5味药材组成，具有清热解毒、止咳化痰的作用，临床上广泛用于治疗发热、急性支气管炎、急性肺炎、慢性阻塞性肺炎等[1-7]，还具有抗病毒、抗菌作用[8-10]，其主要成分有黄酮、酚酸、氨基酸、胆酸等[11-14]。该制剂现行国家药品标准中有2项特征图谱[15]，分别反映山羊角、金银花中氨基酸、酚酸类成分，但尚无反映君药黄芩所含成分的特征图谱，仅测定了黄芩苷、野黄芩苷含量，另外只有文献[7]报道了同时测定芦丁、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷等6种成分的含量。因此，本实验建立痰热清注射液特征图谱，并以黄芩苷为内标，通过一测多评法测定野黄芩苷、千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷含量，为该制剂质量标准的完善提升提供参考。

1 材料

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司，配置四元泵、光电二极管阵列检测器、柱温箱、自动进样器、ChemStation工作站)；BP211D电子天平(0.01 mg，德国Sartorius公司)。黄芩苷(批号110715-201619)、野黄芩苷(批号110842-200102)对照品购自中国食品药品检定研究院；千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷(批号100286)、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷(批号100271)对照品购自江苏永健医药科技有限公司。痰热清注射液样品共33批，包括2016年13批(编号S1～S13，批号分别为1605205、1605206、1607115、1607116、1608216、1608217、1610210、1610211、1611315、1611316、1612219、1612220、1612311)、2017年10批(编号S14～S23，批号分别为1711218、1711219、1711220、1711221、1711222、1711223、1711224、1711225、1711216、1712201)、2018年10批(编号S24～S33，批号分别为1802210、1802211、1802212、1803209、1803207、1803208、1804314、1803210、1803220、1803221)，由上海凯宝药业股份有限公司提供。乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯，购自德国Merck 公司；其余试剂均为分析纯；水为超纯水，由美国Milli-Q超纯水系统制备。

2 方法与结果

2.1 特征图谱建立

2.1.1 色谱条件 Diamonsil Plus C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×25 cm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～30 min，15%～30%A；30～60 min，30%A)；体积流量0.8 mL/min；柱温25 ℃；检测波长280 nm。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取野黄芩苷、黄芩苷、千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷对照品适量，甲醇制成质量浓度分别为25、80、50、25 μg/mL的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 精密量取本品5 mL，置于20 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 专属性试验 通过与对照品保留时间比对，确定5、10～12号峰分别为野黄芩苷、黄芩苷、千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷，阴性无干扰，见图1。

2.1.4.2 精密度试验 取供试品溶液(S1)适量，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，去除黄芩苷峰后导出AIA数据，采用“中药色谱特征图谱相似度评价系统”(2012版)软件计算相似度，发现均大于0.99，表明仪器精密度良好。

2.1.4.3 重复性试验 取本品(S1)6支，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，去除黄芩苷峰后导出AIA数据，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)软件计算相似度，发现均大于0.99，表明该方法重复性良好。

2.1.4.4 稳定性试验 取供试品溶液(S1)适量，室温下于0、4、8、12、16、20、24 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，去除黄芩苷峰后导出AIA数据，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)软件计算相似度，发现均大于0.98，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.5 图谱生成与相似度评价 取33批样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，获得特征图谱，以保留时间适中的黄芩苷(10号峰)为参照，共确定了12个特征峰。去除黄芩苷峰后导出AIA数据，导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)软件进行色谱峰匹配，采用平均值法生成对照特征图谱，见图2。再计算相似度，结果见表1，可知均大于0.97。

表1 33批样品相似度Tab.1 Similarities of thrity-three batches of samples

2.2 一测多评法测定各成分含量

2.2.1 色谱条件 同“2.1.1”项。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取野黄芩苷、黄芩苷、千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷对照品适量，甲醇制成质量浓度均为1 mg/mL的贮备液，分别精密量取2.5、8.0、5.0、2.5 mL至同一量瓶中，制成质量浓度分别为125、400、250、125 μg/mL的对照品溶液，分别吸取0.2、0.4、2、4、5 mL至5 mL量瓶中，即得[野黄芩苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷质量浓度(L1～L5)分别为5、10、50、100、125 μg/mL，黄芩苷质量浓度(L1～L5)分别为16、32、160、320、400 μg/mL，千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷质量浓度(L1～L5)分别为10、20、100、200、250 μg/mL]。

5. 野黄芩苷 10. 黄芩苷 11. 千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷12.白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷5. scutellarin 10. baicalin 11. oroxylin A-7-O-glucoronide12.chrysin-7-O-glucoronide图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

5. 野黄芩苷 10. 黄芩苷 11. 千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷 12. 白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷5. scutellarin 10. baicalin 11. oroxylin A-7-O-glucoronide 12. chrysin-7-O-glucoronide图2 对照特征图谱Fig.2 Reference characteristic chromatogram

2.2.3 供试品溶液制备 取“2.1.3”项下供试品溶液，用于野黄芩苷、千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷含量测定。另精密量取“2.1.3”项下供试品溶液1 mL至20 mL量瓶中，加水溶解置刻度，摇匀，用于黄芩苷含量测定。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液10 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear ranges of various constituents

2.2.4.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得野黄芩苷、黄芩苷、千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷峰面积RSD分别为0.48%、0.29%、0.37%、0.38%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.3 重复性试验 取本品(S1)适量，按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得野黄芩苷、黄芩苷、千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷含量RSD分别为1.27%、0.69%、1.02%、1.13%，表明该方法重复性较好。

2.2.4.4 稳定性试验 取供试品溶液(S1)适量，室温下于0、4、8、12、16、20、24 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得野黄芩苷、黄芩苷、千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷峰面积RSD分别为1.32%、0.31%、0.39%、0.39%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.4.5 加样回收率试验 黄芩苷：由于本品中黄芩苷含量高，故在加样回收率试验中适当减量，即供试品制备方法更改为“精密量取本品0.5 mL，置于2 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1 mL至20 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得”。同时，取样量减半，即精密量取本品0.25 mL(S1)9份，置于2 mL量瓶中，分别精密加入对照品溶液(约1.6 mg/mL)0.5、1.0、1.5 mL各3份，分别相当于原有量的50%(低质量浓度)、100%(中质量浓度)、150%(高质量浓度)，加水至刻度，摇匀，精密量取1 mL至20 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。

野黄芩苷、千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷：精密量取本品2.5 mL(S1)9份，置于20 mL量瓶中，精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0 mL各3份，分别相当于原有量的50%(低质量浓度)、100%(中质量浓度)、150%(高质量浓度)，加水稀释至刻度，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果(n=9)Tab.3 Results of recovery tests for various constituents(n=9)

2.2.5 内标选择 黄芩苷、野黄芩苷对照品容易获取，而千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷对照品目前仅江苏永健医药科技有限公司有售，价格昂贵。由于黄芩苷色谱峰保留时间适中，故选择其作为内标。

2.2.6 相对保留时间、相对校正因子测定 精密吸取对照品溶液10 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，以黄芩苷为内标计算其他3种成分的相对保留时间ti/s和相对校正因子fi/s，公式分别为ti/s=ti/ts(ti为其他成分保留时间，ts为内标保留时间)、fi/s=fi/fs=As×Ci/(Ai×Cs)(Ci为其他成分含量，Ai为其他成分峰面积，Ci为内标含量，As为内标峰面积)，结果见表4，可知两者RSD均小于1.5%，表明其稳定性良好。

表4 各成分相对保留时间、相对校正因子测定结果(n=2)Tab.4 Results of relative retention time and relative correction factor determination of various constituents

2.2.7 耐用性试验

2.2.7.1 体积流量 本实验取对照品溶液(野黄芩苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷质量浓度为25 μg/mL，黄芩苷质量浓度为80 μg/mL，千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷质量浓度为50 μg/mL)适量，考察了体积流量0.7、0.8、0.9 mL/min对相对保留时间和相对校正因子的影响，结果见表5。由此可知，野黄芩苷受体积流量影响较大，其他2种成分受其影响较小，但为了保证千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷色谱峰的分离度，故体积流量不高于0.9 mL/min。

表5 各成分耐用性试验结果Tab.5 Results of durability tests for various constituents

2.2.7.2 柱温 本实验考察了柱温20、25、30 ℃对相对校保留时间和相对校正因子的影响，结果见表5。由此可知，野黄芩苷受柱温影响较大，其他2种成分受其影响较小，并且在20、25 ℃时相对校正因子接近，故柱温不高于25 ℃。

2.2.7.3 色谱柱 本实验考察了Diamonsil Plus C18(5 μm，4.6 mm×25 cm)(A)、Agilent Eclipse Plus C18(5 μm，4.6 mm×25 cm)(B)、Agilent SB-C18(5 μm，4.6 mm×25 cm)(C)色谱柱对相对保留时间和相对校正因子的影响，结果见表5。由此可知，各成分相对保留时间相对稳定；野黄芩苷相对校正因子受色谱柱影响较大，其他2种成分也有一定程度影响；当采用色谱柱B、C时，千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷色谱峰的分离度略有降低，可能是其RSD偏大的原因，故在选择色谱柱时两者色谱峰必须达到基线分离。

2.2.7.4 仪器 本实验考察了Agilent 1260(A)、Agilent 1290(B)色谱仪(均配置二元泵)对相对保留时间和相对校正因子的影响，发现各成分两者RSD均小于1.6%，可见色谱仪对其无明显影响。

2.2.7.5 结论 当检测条件发生变化时，各成分相保留时间相对稳定；千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷相对校正因子耐用性较好，而野黄芩苷相对校正因子受条件变化的影响较大，不适合采用一测多评法。由于野黄芩苷对照品易得，故采用外标法测定其含量。

2.2.8 样品含量测定 取9批样品(S3～S4、S12、S14、S17、S20、S24～S25、S28)，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，分别采用外标法、一测多评法测定含量，结果见表6。由此可知，2种方法所测野黄芩苷含量相对偏差较大，其中一测多评法偏低；其他2种成分含量基本一致，表明可以用一测多评法代替外标法测定两者含量。

表6 各成分含量测定结果(Ⅰ)Tab.6 Results of content determination of various constituents(Ⅰ)

同法测定33批样品中各成分含量，结果见表7，可知同一年份不同批次样品中各成分含量RSD均小于10%(2016年样品中野黄芩苷含量除外)，表明其一致性较好。现行国家药品标准中，黄芩苷、野黄芩苷含量限度规定为“本品每1 mL含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计，应为5.0～8.0 mg；以野黄芩苷(C21H18O12)计，应为50～150 μg”，本实验33批样品均满足上述要求。以各成分含量平均值的±50%为上下限范围，规定每1 mL本品含千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷100～300 μg、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷50～150 μg。

表7 各成分含量测定结果(Ⅱ)Tab.7 Results of content determination of various constituents(Ⅱ)

3 讨论

本实验根据痰热清注射液制备工艺[15]，将黄芩水煎液经调节pH值、醇沉后得提取物，再将其与其他药材提取物合并，通过调节pH值、超滤、灭菌等步骤制得成品，主要保留了黄芩中大极性黄酮苷类成分。再对中间体黄芩提取物进行分析，发现黄芩素含量较高，但在制备过程中该成分已基本不存在，而千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷被进一步富集，故在痰热清注射液质量标准提升中很有必要增加这2种成分的含量测定，但两者对照品难以获取，价格昂贵，故本实验建立一测多评法[16-18]，以容易获取的黄芩苷为内标，并对相对保留时间、相对校正因子的耐用性进行考察。

痰热清注射液中黄芩苷、野黄芩苷含量相差100倍，其现行质量标准需要2种测定方法，费时费力。因此，本实验通过稀释供试品溶液，在同一个色谱条件下进行含量测定，可大大提高分析效率。

4 结论

本实验针对痰热清注射液中黄芩所含成分质量控制不够全面的问题，建立了特征图谱和一测多评含量测定方法，进行了全面的方法学考察，并根据33批样品中野黄芩苷、黄芩苷、千层纸素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷含量测定结果，给新增成分制订了限度，对该制剂质量标准的完善提升具有重要参考价值和指导意义。