臭黄荆叶果胶分子量和单糖研究※

●潘 妍 贾红亮 林少华 黄广学 汤久杨（北京农业职业学院 北京 102442）

臭黄荆（Premna hainanensia）为马鞭草科臭黄荆属植物[1]，主要分布于四川、重庆、贵州、湖北及江西等地区[2]。目前关于臭黄荆的报道较少，主要集中于臭黄荆的黄酮和多酚物质，卢秀彬[3]对臭黄荆叶中黄酮和多酚、醇提物抗氧化性、挥发油成分做了测定分析；黄思雨等[4]对臭黄荆叶水提液的黄酮、多酚含量、抑菌能力、抗氧化能力做了分析测定；徐小青等[5]对2种臭黄荆叶主要挥发性成分及驱虫作用做了研究。关于臭黄荆中果胶分子量鲜有报道，本研究采用从湖北丹江口移栽至北方（北京农业职业学院）的臭黄荆叶，对臭黄荆果胶提取及理化性质进行试验研究，以期为我国开发果胶新原料提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

臭黄荆由湖北丹江口移栽至北京农业职业学院。三氟乙酸（TFA），甲醇，吡啶，三甲基氯硅烷（TMCS），六甲基二硅氮烷（HMDSZ），氯仿，单糖标品（阿拉伯糖，鼠李糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖和半乳糖醛酸）等。

离心机 （Sigma 公司），DSHZ-300 多用途水浴恒温振荡（江苏太仓市实验设备厂），新世纪T6紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），高效凝胶色谱LC-20AD型泵，CTO-20A型柱温箱，KW-G预柱，KW-803色谱柱（Shimadzu公司），DAWN HELEOS-Ⅱ型激光多角度检测器，Optilab rex 型示差检测器（美国Wyatt Technology公司产品），分子量分析软件：ASTRA（版本号5.3.4.13），（GCMS-QP2010 Plus Shimadzu 公司）。

1.2 方法

1.2.1 臭黄荆果胶提取工艺流程臭黄荆鲜叶烘干后粉碎，选取响应面优化得到最优工艺参数，提取温度69.92℃，提取时间1.53 h，pH 1.89。提取后离心取上清，再用旋转蒸发仪进行减压浓缩，乙醇沉淀洗涤后，经冷冻干燥得到果胶。

1.2.2 臭黄荆果胶测定方法臭黄荆果胶测定采用咔唑比色法。将臭黄荆提取液用水稀释至适量浓度（含半乳糖醛酸10～70 mg/L）。取1 mL稀释液，加入6 mL浓硫酸混匀。在65℃水浴中加热15 min，再冷却至室温。加入0.15%咔唑试剂1 mL，避光充分混匀，室温下放置30 min。以试剂空白调零，在530 nm波长下测定果胶含量。以D-半乳醛酸标准曲线对所得果胶进行定量。

1.2.3 分子量测定使用分子体积排阻色谱串联多角度激光散射检测器进行果胶的分子量和聚合度分析[6]。果胶样品浓度为2.5 mg/mL；流动相：0.1 mol/L NaNO2；进样量为200 μL；色谱柱：KW-G（预柱）与KW-803 （Shimadzu CO. LTD.）串联；流速：0.5 mL/min；检测器：多角度激光散射检测器（DAWN HELEOS-Ⅱ光散射检测器）、示差检测器（Optilab rex）均为Wyatt Technology公司产品，分子量分析软件：ASTRA（版本号 5.3.4.13）。

1.2.4 果胶单糖测定

1.2.4.1 果胶单糖衍生化按照文献[7]进行衍生化。称取10 mg 果胶，置于安培管中；加入2 mL TFA，密封于110℃，水解2 h；加入适量甲醇，减压蒸干，重复3次除尽TFA。在5 mg标准品：阿拉伯糖（Ara）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）和半乳糖（Gal）或者上述干燥后的样品中，加入100 μL吡啶、68 μL HMDS和22 μL TMCS，所得混合溶液70℃水浴30 min。在混合液中加入适量水和氯仿进行液-液萃取。氯仿溶液经0.22 μm有机滤膜过滤后供GC-MS分析。

1.2.4.2 色谱柱安捷伦HP-innowax（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；载 气：He；进样 口温 度：250℃；分 流 比20∶1；进 样 量：1 μL；流 速：1 mL/min；升温程序：初温80℃，以2℃/min速率升到180℃后保持0 min，继续以10℃/min升温到230℃后保持0 min。离子源温度：230℃，电离能量EI 70 ev，接口温度230℃，扫描范围20～1000 m/z，溶剂延迟3min采集数据。根据总离子流图分离出的各组分，利用标准质谱库检索质谱图，查阅质谱手册并与文献核对鉴定出来的化学物质，采用面积归一化法计算各种组分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 果胶测定

臭黄荆果胶提取液经过脱色、纯化后得到白色果胶粉末，测定其半乳糖醛酸含量为85.13%。

2.2 分子量测定

用高效凝胶色谱测定分子量，通过 ASTRA 5.3.4.13软件分析可得到相关结果，见图1和表1。

图1 臭黄荆果胶分子量测定色谱图

表1 臭黄荆果胶分子量测定数据表

由表1可知，臭黄荆果胶粗品中含有4种不同分子量的果胶，平均分子量分别为1.966×105，3.992×104，3.797×104，2.965×104Da；平 均 分子半径为34.4，48.7，59.1，65.3 nm。重均分子量（MW）/数均分子量（Mn）值分别为2.072，1.030，1.052，1.046，当重均分子量（MW）/数均分子量（Mn）接近1，说明臭黄荆果胶粗品中分子量分布集中在平均分子量左右。其中重均分子量（MW）表示聚合物中用不同分子量的分子重量平均的统计平均分子量，数均分子量（Mn）表示聚合物中用不同分子量的分子数目统计平均分子量。其中峰1和峰2是主要成分，分别占比53.539%和32.547%。

2.3 臭黄荆果胶单糖测定

分别利用气相色谱-质谱联用仪分析标准单糖衍生物、臭黄荆果胶样品衍生物，见图2。

图2 气相色谱法测定果胶单糖组成

各种单糖标品衍生物按照出峰的时间依次为阿拉伯糖（Ara）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）和半乳糖（Gal）。从图2可知，臭黄荆果胶中含有鼠李糖、葡萄糖、半乳糖等中性糖，其中葡萄糖为主要成分。

3 结论

在最佳工艺条件下提取臭黄荆果胶，经纯化后测得半乳糖醛酸含量为85.13%。再通过高效凝胶色谱测定臭黄荆的果胶分子量，可知臭黄荆果胶含有2个主要成分，分别占比53.539%和32.547%，其平均分子量分别为1.966×105，3.992×104Da；平 均 分 子 半 径 分 别 为34.4，48.7 nm。用气质联用测定果胶中单糖成分，得到果胶中含有鼠李糖、葡萄糖、半乳糖等中性糖，其中葡萄糖为主要成分。

臭黄荆野生资源非常丰富，产量较大，食用和药用价值较高，本试验测定了果胶分子量和其他单糖成分，后续试验可以对其他性质如抑菌性、抗氧化性等进一步分析，为开发产品提供更多的理论支撑。