土层置换对连作土壤微生物及再植幼苗的影响

段亚楠，陈学森，沈 向，姜远茂，尹承苗，毛志泉

（山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点试验室，山东 泰安 271018）

苹果是我国山东部分地区主要的经济农作物，由于土地和水源有限，栽培模式单一，随着栽植年限的增加，连作障碍现象普遍发生且危害严重［1］。连作障碍是指即使在正常水肥管理下，也会出现植株生长衰弱、矮化、叶片小，甚至植株死亡等现象［2-3］，前人研究表明生物因素是引起连作障碍现象发生的主导因素［4-5］。

通过对山东省苹果园土壤养分状况的研究发现，由于果树的长期定植及化肥农药的过量施用，有机质含量显著降低，土壤中一些有益微生物的生长受到抑制，数量减少，以镰孢属为代表的有害真菌数量增加，土壤微生物群落结构由高肥的细菌型向真菌型转变，从而影响新栽幼苗生长［6-8］，而土层置换技术是近年来逐渐兴起的一种农业耕种措施，可以改变原有的土壤结构，有效消除土壤农药残留对作物的毒害作用，从而达到稳产、高产的目的［9］。宫秀杰等［10］研究表明土层置换可以有效改良松嫩平原北部盐碱地的土壤理化性状，降低0～40 cm耕层土壤容重，提高土壤含水量，促进根系生长，提高产量。周旺明等［11］研究发现在多次冻融交替过程中，土体的膨胀和收缩会释放出小分子有机质等，导致土壤微生物种群数量及结构发生改变，土壤微生物群落由C/N较高的真菌群落转变为C/N较低的细菌群落，但土层置换这一方法在防治苹果连作障碍方面的研究鲜有报道。本试验从土层置换这一防治方法出发，以平邑甜茶幼苗和嫁接苗为试验材料，研究土层置换对连作条件下幼苗生长、土壤微生物数量、净光合速率及土壤阳离子交换量等指标的影响，以期为老龄苹果园更新提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

试验于蒙阴、莱州和栖霞三地25年生老龄苹果园进行，土壤基本理化性质见表1。2012年12月15日，在这三地果园进行果园清理及挖沟处理，在每个果树原行位置挖2条100 cm×50 cm×60 cm的沟，并将0～30和30～60 cm 2土层土壤摊开放置，取土样作为冬前土。2013年3月15日，将年前挖的沟回填，回填时分为原位回填（CK）和土层置换（SLR）2个处理，回填时严格处理，做好位置标记，并取土样作为冬后土。

表1 三地老龄果园土壤基本理化性质

2013年清明节前后栽植2年生苹果嫁接苗，砧穗组合为烟富3号/M9T337，购自莱州大自然园艺科技有限公司。栽植株行距为1.5 m×4 m。2013年4月25日，在回填后2条沟的位置定植平邑甜茶（Malus hupeheusisRehd.）幼苗，每个处理20个重复。

分别于2013年5、7、9月取土样，观察土层置换以后各土层土壤微生物数量的动态变化情况。2013年和2014年9月测定幼苗生物量，观察处理对再植幼苗生长的影响。

供试材料为平邑甜茶实生苗。2013年1月10日将平邑甜茶种子于4 ℃层积30 d左右，待种子露白后，播种于装有育苗基质的营养钵中进行育苗，当幼苗长至6片真叶时选取长势一致、无病虫害的植株进行栽植。

蒙阴、莱州和栖霞三地果园分别记做M、L和Q；0～30和30～60 cm土层的土样分别记做A和B；原位回填处理和土层置换处理分别记做CK和SLR。

1.2 测定指标

用卷尺、游标卡尺和电子天平分别测定幼苗株高、地径、干鲜重，干样需将样品置于信封袋中，在108 ℃的烘箱中杀青30 min，然后在80 ℃烘至样品恒重。总枝长，每处理选择3株树，每株树的枝条使用软米尺测量长度；百叶重，每处理随机抽取5株树，每株树随机采集20片正常叶，共100片，称百叶重。

采用CIRAS-3便携式光合仪（PP System，英国）测定气体交换参数。选择晴天无风的9：00～11：00，测定时光强稳定约为1100 μmol/（m2·s），温度为（25±1）℃，空气中CO2浓度为（380±10）μmol/mol，相对湿度变化范围为58%～62%，每个处理选取3株长势一致植株的第4片健康功能叶，测定其净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率等光合参数。

土壤中细菌、真菌、放线菌的数量均采用平板涂布稀释法测定，测定前计算水分系数。细菌采用酵母膏蛋白胨琼脂培养基，真菌采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，放线菌采用高氏一号培养基［12］。所有数据最后通过测定各自的土壤含水量换算成每克干土的含量，每克样品含菌数=［菌落平均数×稀释倍数］/［接种量×（1-含水量）］［13］。

土壤镰孢菌基因拷贝数的测定参照王晓宝等［5］的方法，使用E.Z.N.A.®土壤DNA提取试剂盒提取土壤DNA，用CFX96TM Thermal Cycler（Bio-Rad）测定。

土壤阳离子交换量的测定参照鲁如坤［14］的乙酸铵法。

参照鲍士旦［15］《土壤农化分析》（第3版）的方法，对土壤氮、磷、钾和有机质进行测定。有效磷用钼锑抗比色法；速效钾用火焰光度法；有机质用重铬酸钾容量法（稀释热法）；铵态氮和硝态氮（NH4+-H和NO3--N）用CaCl2浸提流动注射分析仪法。

土壤pH的测定：称取过1 mm筛的鲜土样10 g，将土壤与中性水以1∶2.5的比例搅拌混匀，放置30 min后用酸度计进行测定。

土壤质地的测定：根据美国制土壤分类标准，采用微吸管法［16］。

1.3 数据处理

采用Excel 2003进行数据处理和作图，采用SPSS 19.0进行统计分析，采用邓肯氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 土层置换对平邑甜茶幼苗生物量的影响

由表2可以看出，三地老龄苹果园土壤经过土层置换（SLR）后，平邑甜茶幼苗的株高、地径、鲜重和干重均高于原位回填（CK）处理，其中以栖霞果园效果最显著，其土层置换（QSLR）后平邑甜茶幼苗的株高、地径、鲜重和干重分别是原位回填处理（QCK）的1.42、1.17、1.27和1.25倍。

表2 土层置换对平邑甜茶幼苗生物量的影响

2.2 土层置换对富士/M9T337嫁接幼苗生物量的影响

表3反映了原位回填（CK）和土层置换（SLR）处理对连作嫁接幼树在2013到2014年生长的影响。结果表明，土层置换（SLR）处理可以显著提高连作嫁接幼树的株高、地径、总枝长、鲜重和百叶重。其中以栖霞果园效果最显著，与平邑甜茶幼苗趋势一致。具体表现为：在2013和2014年，土层置换（SLR）处理后的株高分别提高了11.69%和23.48%，地径分别提高了27.61%和34.71%，总枝长分别提高了46.83%和62.51%，鲜重分别提高了52.19%和68.57%，百叶重分别提高了5.97%和5.61%。

表3 土层置换对富士/M9T337嫁接幼苗生物量的影响

2.3 土层置换对老龄苹果园土壤微生物的影响

2.3.1 土层置换对老龄苹果园土壤真菌的影响

由图1可以看出，三地老龄苹果园土壤冻融后，各土层真菌数量均显著降低；但经过原位回填和土层置换处理后，三地上下层土壤真菌数量变化趋势不同，三地果园土壤原位回填处理后，上层土壤（CKA）真菌数量先趋于稳定，降低后再增加；下层土壤（CKB）真菌数量先增加，降低后再趋于稳定。而下层土置换到上层后（SLRB）土壤真菌数量先升高，然后呈下降趋势；上层土置换到下层后（SLRA）土壤真菌数量先增加，最终趋于稳定。土层置换后9月数据结果表明，蒙阴、莱州和栖霞三地土壤上层土置换后（SLRA）真菌数量均显著降低，分别降低了28.1%、18.2%和18.9%；下层土置换后（SLRB）土壤真菌数量分别降低了37.1%、15.9%和23.3%。可见，土层置换不仅可以改变老龄苹果园土壤原有的真菌分布，还可以显著影响土壤真菌的生长。

图1 土层置换对土壤真菌数量的影响

2.3.2 土层置换对老龄苹果园土壤细菌的影响

由图2可以看出，三地老龄苹果园土壤冻融后，各土层细菌数量均显著降低；上下土层经过原位回填（CKA/CKB）和土层置换（SLRA/SLRB）处理后，三地土壤细菌数量变化均表现出先增加后降低再增加的趋势，5和9月土壤细菌数量达到峰值；土层置换后9月数据结果表明，上层土置换后（SLRA），蒙阴、莱州和栖霞三地土壤细菌数量均显著增加，分别增加了38.1%、9.4%和17.9%；下层土置换后（SLRB），蒙阴、莱州和栖霞三地土壤细菌数量分别增加了31.3%、21.2%和40.1%。可见，原位回填处理在改变土壤细菌原有分布的同时，可以增加老龄苹果园各土层土壤细菌的数量。

图2 土层置换对土壤细菌数量的影响

2.3.3 土层置换对老龄苹果园土壤放线菌的影响

由图3可以看出，三地老龄苹果园土壤冻融后，各土层放线菌数量均显著降低；上下土层经过原位回填（CKA/CKB）和土层置换（SLRA/SLRB）处理后，三地土壤放线菌数量变化均表现出先趋于稳定后增加的趋势，其中蒙阴和栖霞两地变化差异较小；土层置换后9月数据结果表明，上层土置换后（SLRA），蒙阴、莱州和栖霞三地土壤放线菌菌数量均显著降低，分别降低了38.0%、24.9%和51.9%；下层土置换后（SLRB），莱州和栖霞两地土壤放线菌数量分别降低了26.9%和2.8%，而蒙阴增加了24.2%。

图3 土层置换对土壤放线菌数量的影响

2.3.4 土层置换对老龄苹果园土壤细菌/真菌的影响

由图4可以看出，三地老龄苹果园土壤冻融后，各土层土壤细菌/真菌值均显著升高；上下土层经过原位回填（CKA/CKB）和土层置换（SLRA/SLRB）处理后，三地土壤细菌/真菌值均表现出先趋于稳定后增加的趋势，土层置换后9月数据结果表明，上层土置换后（SLRA），蒙阴、莱州和栖霞三地土壤细菌/真菌值分别为1.45×103、1.35×103和2.94×103；下层土置换后（SLRB），蒙阴、莱州和栖霞三地土壤细菌/真菌值分别为1.94×103、2.03×103和2.87×103；而原位回填处理后，上层土原位回填后（CKA）土壤细菌/真菌值分别为0.76×103、1.05×103和2.02×103；下层原位回填后（CKB）土壤细菌/真菌值分别为0.93×103、1.61×103和1.80×103。可 见，土层置换处理后可以显著增加三地果园各层土壤的细菌/真菌值，促使果园土壤向着高肥的细菌型转变。

图4 土层置换对土壤细菌/真菌的影响

2.4 土层置换对土壤中4种镰孢菌的抑制效果

由表4可以看出，三地老龄苹果园上层土壤4种镰孢菌的基因拷贝数均显著高于下层，经过土层置换后，三地上下层土壤4种镰孢菌的基因拷贝数均有所降低，且表现出显著性差异，其中以轮枝镰孢菌的基因拷贝数降低最显著，尖孢镰孢菌次之。蒙阴上下层土壤尖孢镰孢菌和轮枝镰孢菌基因拷贝数分别降低了39.35%、40.93%和21.65%、46.56%。莱州上下层土壤尖孢镰孢菌和轮枝镰孢菌基因拷贝数分别降低了19.53%、5.11% 和40.95%、42.63%；栖霞上下层土壤尖孢镰孢菌和轮枝镰孢菌基因拷贝数分别降低了10.38%、25.86%和25.37%、26.58%。可见，土层置换处理对土壤中镰孢菌有很好的抑制效果。

表4 土层置换对土壤镰孢菌基因拷贝数的影响

2.5 土层置换对土壤阳离子交换量的影响

从图5可以看出，三地老龄苹果园土壤上下土层置换后，土壤的阳离子交换量变化不同；蒙阴、莱州和栖霞三地上层置换到下层后土壤阳离子交换量均显著高于上层土壤原位回填处理，分别增加了4.0%、25.4%和42.6%；而下层土置换到上层后除栖霞土壤阳离子交换量增加外，蒙阴和莱州两地土壤阳离子交换量分别降低了16.1%和10.1%。可见，土层置换对三地各土层土壤阳离子交换量的影响不同。

图5 土层置换对土壤阳离子交换量的影响

2.6 土层置换对平邑甜茶幼苗叶片光合效率的影响

从图6可以看出，蒙阴、莱州和栖霞三地老龄苹果园土壤经过上下土层置换后，平邑甜茶幼苗的净光合速率、蒸腾速率与胞间CO2浓度均显著高于原位回填处理，其中净光合速率分别增加了20.4%、16.1%和18.0%；蒸腾速率分别增加了11.9%、20.1%和22.5%；胞间CO2浓度分别增加了1.3%、4.8%和5.6%，差异均达显著性水平；但气孔导度变化差异不一致，蒙阴和莱州两地分别显著增加了17.7%和10.6%，而栖霞显著降低了31.2%。

图6 土层置换对平邑甜茶幼苗叶片光合效率的影响

3 讨论

3.1 土层置换促进老龄苹果园再植幼苗的生长

土壤是果树所需水分和矿质营养的主要来源，良好的水、肥、气、热环境，可以促进果树根系的生长［13，17］。朱宝国等［18］研究发现果树的连年栽植和农药的过量施用，会造成耕层土壤养分失衡，使原来有利于作物生长的“肥沃土层”变成不利于作物生长的“毒土层”。高中超等［19］研究发现，残留农药及除草剂主要集中分布在0～10 cm表层土壤，而将上下土层进行置换后，不但可以消除残留农药及除草剂对作物的毒害，还有利于不同土层土壤养分均匀分布，提高土壤通透性，改善土壤的物理性质，为作物生长提供良好的土壤环境，从而提高作物产量［20-23］。目前土层置换技术主要应用于解决农作物连作的问题，通过土层置换后，大豆重迎茬地块增产16.8%，种植玉米增产2%，种植甜菜增产637.3%，种植马铃薯增产104.1%［24-26］，王洋等［27］研究发现冻融会影响土壤有机质含量，改善土壤理化性质。在本试验中，三地老龄果园土壤经过土层置换后可以显著促进平邑甜茶幼苗地上及地下部分的生长，可能是土层置换处理后改善了土壤环境，从而减轻了连作障碍对再植幼苗生长的影响。

3.2 土层置换降低土壤中致病菌数量并改善连作土壤微生物群落

细菌、放线菌和真菌是土壤微生物的三大主要类群，其种群数量、分布与活性等代表了土壤中养分循环和营养转化的程度，同时也可以作为评价土壤质量和健康状况的重要指标［28-30］。土壤微生物的种类、数量及活动能力主要受土壤温度、水分［31］、营养状况及土壤理化性质等的综合影响［32］。李智卫等［33］研究发现，同种或同科作物在长期栽植条件下，土壤肥力变差，土壤细菌数量明显减少，有害真菌数量明显增加，影响植物的生长发育，且老龄苹果园土壤微生物数量具有明显的垂直分布规律，一些有害真菌主要集中在表层土壤，并随着土壤深度的增加而减少［34-35］。Westcott［36］研究发现，放线菌也是导致再植病的主要因素。而土层置换技术可以改变原有土层结构，全面活化土壤养分，提高土壤酶活性，致使土壤微生物数目发生改变，增加土壤整体微生物活性［9，37-38］。在本试验中，三地老龄苹果园土壤冻融以后，各土层真菌、细菌和放线菌数量均显著降低，这与宋阳等［39］在冻融作用上的研究结果一致；上下土层置换处理后，土壤真菌和细菌数量都表现出先降低后增加的趋势，降低原因可能是机械作业对土壤结构及养分含量造成了一定的影响［21］；且上下土层置换后土壤真菌和放线菌数量均降低，有害镰孢菌的基因拷贝数也显著下降，细菌数量增加，土壤细菌/真菌值均显著增加，使果园土壤微生物群落整体向着有益于果树生长的方向发展。

3.3 土层置换影响土壤阳离子交换量

土壤胶体表面所能吸附的各种阳离子总量称为土壤阳离子交换量［40］，其大小可以作为衡量土壤保水保肥能力的指标及农田土壤改良和合理施肥的重要依据［41］。土壤阳离子交换量主要与土壤质地、有机质含量及土壤pH等多种因素有关［20，42］；通过土壤阳离子交换量的变化，可以判断土层置换对土壤保水保肥能力的影响。在本试验中，三地老龄苹果园土壤上下土层置换后，上层置换到下层后土壤阳离子交换量均显著升高，可能与上层土置换到下层后土壤缓和了农药残留对土壤造成的危害有关，下层置换到上层后土壤阳离子交换量变化不同，除栖霞土壤阳离子交换量增加外，蒙阴和莱州两地土壤阳离子交换量均显著降低，降低的原因可能与土壤孔隙度及土壤粘粒含量变化有关［43-44］，但各地均值都低于20.0 cmol/kg，土壤肥力欠缺。张墨［45］研究发现，腐殖质等物质可以有效改善土壤阳离子交换量，因此可以在农田土壤中适当施加肥料，有效增强土壤的保肥保水能力，从而达到更好的防治效果。

3.4 土层置换影响平邑甜茶幼苗的光合作用

光合作用是植物利用光能，合成有机物并释放氧气的过程［46］，也是植物体干物质积累的主要来源，对植株的生长发育具有重要作用［47-48］。光合作用受到抑制后，会造成吸收的光能过剩，产生过量的活性氧和丙二醛等膜脂过氧化物，使植物体内活性氧代谢失衡，破坏生物膜结构，光合能力下降［49-50］。王才斌等［51］研究发现，花生连作2年后，单叶光合速率降低了3.3%，群体光合速率降低了5.4%，造成干物质积累减少，产量降低；且番茄、辣椒连作后也会导致光合叶片减小，植株整体光合物质积累降低，造成产量下降［52］。叶片的净光合速率、蒸腾速率等光合参数是植物外部环境因子（比如CO2浓度、气温、光照强度、水分和养分供应等）和内部生理反应（如羧化酶活性、电子传递速率等）综合作用的结果［53-57］，这些参数的变化直接反映了植物在光合生理上对环境条件的适应程度［58-59］。本试验研究发现，蒙阴、莱州和栖霞三地老龄苹果园土壤经过上下土层置换后，平邑甜茶幼苗的净光合速率、蒸腾速率与胞间CO2浓度均显著高于原位回填处理，植株光合能力增强，提高了对环境的适应能力；蒙阴和莱州两地气孔导度也明显增加，但栖霞降低了31.2%，分析可能与当地干旱、温度过高及内部生理反应等有关［60］。

4 结论

老龄苹果园在土层置换后，可以显著促进平邑甜茶幼苗的生长和植株叶片的光合作用；降低土壤真菌数量，增加土壤细菌数量和土壤细菌/真菌值，同时降低了土壤中4种有害镰孢菌的基因拷贝数，优化了土壤微生物群落结构，说明土层置换可以有效缓解老龄苹果园连作障碍。