全年稻麦秸秆还田对稻田土壤细菌群落结构的影响

王娟娟，朱紫娟，钱晓晴，王桂良

（扬州大学，江苏 扬州 225007）

秸秆还田不仅能够实现农业废弃物资源化利用，还可以促进土壤有机质积累、改善土壤微生物环境，维持土壤可持续发展［1-2］。土壤微生物在维持农田土壤健康、生产力及其可持续性等方面具有非常重要的作用。细菌是土壤微生物中含量最多、丰富度最高的类群，其群落结构的变化将显著影响土壤养分循环过程。因此，土壤细菌群落结构是反映农田土壤肥力状况的重要指标之一［3］。

长期施用化肥的农田土壤细菌多样性和数量均显著降低，群落结构也发生显著变化［4］。而秸秆还田在改变农田土壤理化性质的同时，也会改变土壤微生物群落结构。近年来，随着我国生态农业的大力发展，秸秆还田被认为是维持土壤肥力、实现粮食增产增效、防止农业面源污染的重要措施［5-7］。李录久等［8］研究表明水稻氮肥运筹配合实施小麦秸秆直接还田，稻田土壤有机质、碱解氮、有效磷和速效钾含量都明显提高，土壤CEC和pH增大，其酸化程度减轻。刘骁蒨等［9］认为秸秆覆盖还田配施适量的氮磷钾肥能显著提高稻田土壤微生物生物量碳、氮和土壤的细菌多样性。其他研究同样表明，秸秆还田施用氮肥可显著增加土壤养分含量，增强土壤酶活性，且有利于土壤细菌群落多样性和稳定性的提高，改善土壤微生物环境，实现作物增产增效［10］。

前人的这些研究多集中在某一季作物秸秆还田对当季土壤理化性质和微生物群落结构的研究，而秸秆还田后在土壤中经微生物分解矿化是个漫长过程，有必要在全年尺度探讨其对土壤生态环境的影响。另外，这些研究大多采用的是培养法、变性梯度凝胶电泳和磷脂脂肪酸分析等传统方法，工作量大且获得的信息量少。因此，本研究采用Illumina高通量测序技术，探讨在全年尺度下稻麦轮作系统中稻、麦秸秆全量还田对稻田土壤理化性质和细菌群落结构的影响，以探讨稻麦轮作系统中秸秆全量还田在改善土壤生态环境方面的可行性，为推行秸秆全量还田、实现培肥土壤和藏粮于地提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验概况

本试验于2019～2020年在江苏省扬州市扬州大学农学院试验农场（32°30′N，119°25′E）进行，属于亚热带季风性湿润气候，年均气温14.5 ℃，年均降水量1000 mm，年均日照时数2300 h。土壤质地为砂壤土，含有机质22.85 g/kg、碱解氮115.16 mg/kg、有效磷49.43 mg/kg、速效钾72.72 mg/kg。供试水稻品种是淮稻H5，小麦品种是扬麦16。

1.2 试验设计

试验设置4个处理（图1）：全年稻和麦秸秆均不还田（CK）、小麦季稻秸秆还田（W-RS）、水稻季麦秸秆还田（R-WS）、全年稻和麦秸秆全量还田（RWS）。各小区人工收割，留茬约10 cm，秸秆还田处理中植株脱粒后通过秸秆粉碎机粉碎为5～10 cm的小段，全部均匀施入小区内，利用小型旋耕机将秸秆旋耕入土0～15 cm。秸秆不还田处理中植株脱粒后的秸秆不还田，小区同样进行旋耕。参考当地推荐施肥量，水稻施氮240 kg/hm2，分基肥、分蘖肥、促花肥施用，比例为5∶2∶3；小麦施氮210 kg/hm2，分基肥、拔节肥施用，比例为4∶6。磷、钾肥均为90 kg/hm2，作基肥一次性施入。氮、磷、钾肥分别为尿素（N 46.4%）、过磷酸钙（P2O513.5%）、氯化钾（K2O 63%）。各处理随机区组排列，重复3次，小区面积25 m2，小区之间筑田埂并用塑料薄膜覆盖，以防肥水串灌。其他田间管理按当地常规方法进行。

图1 试验处理描述的示意图

1.3 测定项目与方法

在 水 稻 收 获 前1 d（2020年10月30日），用直径约为5 cm的土钻采集0～5、5～10和10～15 cm耕层土壤，每个小区按照“S”形15点取样，每个土层混合成1个土壤样品，剔除其中的植物残体或石砾等杂质，装入灭菌自封袋暂存于冷冻保温箱中，迅速带回实验室。将每份土壤样品分为2份，一份经风干后用于测定土壤理化性质，包括pH、EC及有机质、全氮、全磷、碱解氮、有效磷含量，测定方法参照鲍士旦的《土壤农化分析》［11］。

另一份于-80℃保存，用于土壤DNA的提取。土壤DNA采用Power soilTMDNA试剂盒（MoBio Laboratories，Solana Beach，CA）进行提取，每个样本3个重复。提取后的土壤DNA，采用16S rRNA基因V3～V4区通用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGF-3）；806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAATR-3’），目标片段长度为468 bp。进行PCR扩增，后续文库构建、Miseq测序、序列拼接均在上海美吉生物医药有限公司的Illumina MiSeq PE300测序平台进行［12］。

1.4 数据分析

样品理化性质方面采用Excel 2010处理数据、绘制图表。采用SPSS 19.0进行数据间多重比较（LSD法）和相关性分析。

高通量数据的生物信息学分析在美吉平台生物云（http：//www.i-sanger.com）进行。根据序列的相似度，将有效序列聚类为OTU（97%相似度）。采用细菌16S rRNA对比库Silva（Release132，http：//www.arb-silva.de）对各OTU进行物种注释。获得各样本的细菌分类学信息，及各个分类水平上的群落物种组成。根据样品门水平上物种注释及丰富度绘制群落柱图，并计算细菌多样性，获得相关指数。根据土壤细菌群落各菌门相对丰度值，采用单因素方差分析，分析不同样本间门水平上物种丰度差异的显著性，获得样本间显著性差异物种。各样品的细菌群落多样性比较采用student’s T test方法。为避免多重共线性采用方差膨胀因子VIF等检验，逐步剔除VIF大于10的变量。最后用冗余分析计算理化性质、样品细菌群落组成分布及主要OTU之间关系的相关性。

2 结果与分析

2.1 秸秆还田对稻田土壤理化性质的影响

各土层都表明秸秆还田处理土壤含水率较高（表1），0～15 cm土层CK处理土壤平均含水率为24.79%；W-RS和R-WS处理间差异不显著，平均为25.69%；RWS处理最高，为27.29%。土壤含水率随土层加深有下降趋势。0～5 cm土层R-WS和RWS处理有机质含量平均为28.45 g/kg，显著高于CK和W-RS处理；5～10 cm土层RWS处理显著高于其他各处理；10～15 cm土层各处理间差异不显著，平均为23.17 g/kg。土壤有机质随土层加深有下降的趋势。pH在各处理间差异不显著，0～15 cm土层土壤pH平均为6.81。与CK处理相比，秸秆还田各处理土壤EC都有所增加，W-RS、R-WS、RWS处理间无显著差异。

表1 秸秆还田对稻田土壤理化性质的影响

秸秆还田处理土壤全氮含量较高，0～15 cm土层CK和W-RS处理土壤全氮含量分别平均为1.16和1.18 mg/kg，R-WS处理为1.26 mg/kg，RWS处理最高，为1.37 mg/kg。各土层土壤全磷含量都以RWS处理最高，0～15 cm土层平均为1.96mg/kg，CK处理最低，为1.46 mg/kg。秸秆还田提高了土壤碱解氮含量，各土层R-WS和RWS处理碱解氮含量都显著高于CK处理，W-RS与CK处理差异不显著，平均为81.26 mg/kg。各土层RWS处理土壤有效磷含量最高，0～15 cm土层W-RS和R-WS处理间差异不显著，平均为84.66 mg/kg。各土层速效钾含量以R-WS和RWS处理最高，平均为132.47 mg/kg，CK和W-RS处理间差异不显著，平均为117.59 mg/kg。总体而言，随土层加深，氮磷钾各指标含量都有下降趋势，秸秆还田各处理都较CK处理有所增加，其中RWS处理较高。

2.2 秸秆还田对稻田土壤细菌群落结构的影响

对土壤样品测序结果进行分析，共获得有效序列1278919个，平均长度为440 bp。按最小样品数时行序列抽平，基于97%相似度的聚类分析得到5970个OTU，分别代表49个细菌门、135纲、424科和725属。对不同处理土壤细菌群落结构进行Alpha多样性分析（表2），表征群落丰富度的Sobs和Chao指数具有相似的变化规律，0～5 cm土层秸秆还田土壤细菌丰富度略低，5～10 cm土层除RWS处理其他处理丰富度均有所下降，10～15 cm土层W-RS处理的Sobs和Chao指数略有下降。但是各处理间丰富度指数差异并不显著。群落多样性Shannon和Simpson指数在各处理间无显著性差异。可见，本试验中秸秆还田处理对稻田土壤细菌群落多样性无显著性差异。

表2 不同秸秆还田处理中土壤细菌α 多样性变化

图2为门水平上各处理土壤的细菌群落组成，其他（others）为相对丰度小于1%的菌门。各处理主要优势菌门包括变形菌门（Proteobacteria）（38.9%）、酸杆菌门（Acidobacteria）（17.0%）、绿弯菌门（Chloroflexi）（14.1%）、拟杆菌门（Bacteroidetes）（5.3%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）（4.2%）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）（3.6%）、放线菌门（Actinobacteria）（2.2%）、Parcubacteria（2.2%），共占总序列的87.5%。变形菌门在所有处理中相对丰度最大，R-WS处理在0～5 cm土层最高，而在5～10、10～15 cm土层则最低。居于第二的酸杆菌门在各处理土壤的分布趋势则与变形菌门相反。在0～5 cm土层，各处理之间细菌门相对丰度并没有显著差异；5～10与10～15 cm分别只有绿弯菌门（Chloroflexi）和硝化螺旋菌门（Nitrospirae）存在显著差异。

图2 不同秸秆处理土壤门水平上细菌群落组成

细菌科水平上的前三位优势菌为酸杆菌（Acidobacteria）、厌氧绳菌科（Anaerolineaceae）和芽单胞菌科（Gemmatimonadaceae）（图3），在各处理中平均相对丰度分别为8.63%、7.08%和3.66%。在0～5 cm表层土壤中，各细菌科所占相对丰度略有差异，但没有达到显著性差异。而在5～10 cm土层，嗜氢菌科（Hydrogenophilaceae）在CK处理中占比为4.06%，秸秆还田各处理显著降低，平均为2.12%。在10～15 cm土层，达到显著差异的细菌科有硝化螺旋菌科（Nitrospira，P=0.027）、嗜氢菌科（Hyrogenophilaceae，P=0.027）、Acidiferrobacteraceae（P=0.018）和嘉利翁氏菌科（Gallionelaceae）（P=0.007）。与CK处理相比，秸秆还田各处理这几类细菌的相对丰度都显著下降。此外，铁氧化菌嘉利翁氏菌科（Gallionellaceae）只存在于5～10和10～15 cm土壤中。

图3 不同秸秆处理土壤在科水平上细菌群落组成

2.3 土壤理化性质与土壤细菌群落结构的关系

对环境因子进行VIF分析，筛选剔除VIF值大于10的环境因子。0～5 cm土层剔除pH（VIF=13.28）；5～10 cm剔除EC（VIF=15.38）、TN（VIF=14.12）；10～15 cm剔除pH（VIF=32.79）、EC（VIF=45.81），再采用冗余分析方法来探讨其他土壤理化性质与细菌群落结构的关系（图4）。总体而言，CK与各秸秆还田处理的样品分布点并没有显著地分隔开，说明秸秆还田对土壤细菌群体结构没有产生显著的影响。0～5 cm土层，前两个主轴可以解释各处理土壤细菌群落组成变异的84.14%（RDA1=73.06%，RDA2=11.08%）。土壤有机质、总氮含量和含水率对细菌群落组成的影响较大；RWS处理与CK和W-RS处理相聚较远，说明全年秸秆还田可能会影响0～5 cm土层土壤细菌群落结构。5～10 cm土层，前两主轴可以解释79.42%的细菌群落总变异，对细菌群落组成影响最大的土壤因子为全磷含量和含水率；土壤磷养分状况是R-WS和RWS秸秆还田处理土壤细菌群体结构的主要影响因素。影响10～15 cm土层细菌群落组成的主要理化性质包括含水率和土壤有效钾含量。综合所有样本，土壤含水率及有机质、总磷和总氮含量是影响各土层细菌多样性的主要理化性质。

图4 基于门水平细菌群落组成与土壤理化性质的冗余分析

进一步对土壤样品中优势细菌门与环境因子的相关性进行分析（图5）。横向为环境因子信息，纵向为物种信息，中间热图对应的值为Spearman相关系数r，介于-1～1之间，r＜0为负相关，*表 示P＜0.05，**表 示P＜0.01，***表 示P＜0.001。相对丰度前10位的菌门中酸杆菌门（Acidobacteria）与土壤含水率呈显著负相关；拟杆菌门（Bacteroidetes）分别与含水率、EC及土壤有机质、速效钾和碱解氮含量呈正相关，除EC之外，其他都达到极显著水平；硝化螺旋菌门（Nitrospirae）则与土壤pH呈显著负相关，与全磷和有效磷含量呈正相关。在科水平上，Saccharibacteria与土壤含水率及全氮、速效钾和碱解氮含量都呈显著正相关。

图5 土壤样品中优势细菌门与环境因子的相关性分析热图

3 讨论

3.1 秸秆还田对稻田土壤理化性质与细菌群落结构的影响

本研究表明，秸秆还田各处理土壤含水率和有机质含量都有所增加（表1），特别是0～5 cm土层土壤各处理间差异显著。其主要原因可能是，在常规耕作方式下，粉碎的秸秆还田后主要集中在表层土壤中，导致土壤有机质含量显著增加，同时增加土壤的保水能力，提高土壤含水率。类似结果也表明秸秆还田显著增加土壤的有机质含量，且随土层深度的增加秸秆还田对土壤有机质含量的影响逐渐减小［13］。与秸秆不还田处理相比，秸秆还田各处理显著增加土壤电导率，其主要原因可能是秸秆还田后释放出更多的营养物质增加溶液中盐类含量，从而使土壤溶液的离子浓度增大［14］。秸秆还田各处理增加各土层土壤全氮、全磷、碱解氮、有效磷和速效钾含量。秸秆中的氮磷钾养分分解转化速率相对无机养分较慢，有利于土壤养分库的累积，从而提高了收获期土壤氮磷钾养分含量［15-16］。另外，秸秆还田改善土壤理化性质及微生物环境，促进化学养分的固定，减少养分损失［17-18］。本研究结果表明，与CK处理相比，小麦季稻秸秆还田处理同样增加水稻收获期土壤有机质和养分含量，主要原因可能是小麦季秸秆还田后在土壤中经历长时间矿化分解，有利于土壤微生物环境的改善和增强土壤团粒结构，从而促进对土壤速效养分的吸附与固持，其作用一直持续到下季水稻收获期［19-20］。

通过改变耕作措施干扰土壤微生物环境的稳定性，施肥量及其种类都会影响土壤微生物的多样性［21］。孙瑞波等［22］通过研究长期秸秆还田与使用化肥对稻田土壤微生物生物量的影响，表明秸秆还田虽然有利于土壤肥力的提高，但并未对土壤细菌群落多样性产生显著影响。本研究同样表明秸秆还田后土壤的细菌Sobs和Shannon指数与全年秸秆不还田处理之间差异不显著。各处理中变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）是细菌群落的前三位优势菌门（图2），这与其他研究结果基本一致［23-24］。整体而言，各处理之间存在显著差异菌门的相对丰度几乎都小于0.5%。然而，目前大多研究主要集中在相对丰度较大的菌门，对这些秸秆还田后存在显著差异的稀有菌门的深入研究可能有助于进一步了解秸秆还田对土壤细菌群落结构的影响机理。

3.2 秸秆还田下稻田土壤理化性质与细菌群落结构的相关关系

土壤是微生物的重要栖息地，一方面直接为微生物的繁殖与生长提供必需的土壤环境条件，另一方面通过影响植物的根系分泌物从而间接地影响微生物群落结构［25］。大量研究表明，土壤理化性质对土壤细菌群落结构具有重要作用，其中pH是影响土壤细菌群落变化的关键因子［26-28］。但本研究中各秸秆还田处理并不显著影响土壤pH，因此，在细菌群落结构与土壤理化性质冗余分析中表明pH并不是秸秆还田措施下显著影响土壤细菌群落变化的理化性质（图4）。0～5 cm土层土壤细菌群落结构与有机质呈显著负相关关系，这与其他的研究结果相似［29-31］。其主要原因可能是秸秆还田增加了土壤有机质含量，为土壤微生物提供重要的能量来源，促进土著优势种群的生长繁殖，而不利于一些非优势种群及对环境变化敏感种群微生物生长与丰度增加。5～10 cm土层土壤细菌群落结构与全磷呈显著正相关关系，与其他研究结果相似［31-32］，其主要原因是秸秆还田增加了土壤有机质含量，主要通过改变土壤理化性状来调控细菌群落组成。本研究中，当其他养分供应充足时，磷可能是成为微生物量的限制因子，因此土壤细菌群落结构受土壤供磷水平的影响。10～15 cm土层土壤细菌群落结构与土壤含水率、碱解氮含量呈显著负相关关系，其主要原因可能是土壤碱解氮累积越多，反而不利于土壤细菌群落结构组成的变化［30，33-34］。因此，通过优化施肥，在满足作物生长对养分需求的同时，尽可能减少养分在土壤中的累积量，有利于改善土壤微生物环境，培肥土壤，促进作物稳产高产。

4 结论

与全年秸秆不还田相比，秸秆还田可提高土壤有机质、氮磷钾养分含量；全年或水稻当季秸秆还田更有利于稻田0～5 cm土层土壤有机质和氮磷钾养分增加。

秸秆还田并没有显著提高土壤细菌多样性指数；各处理中前三位优势菌门为变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi），分别占总序列的38.9%、17.0%、14.1%；各处理间存在显著差异的菌门主要集中在相对丰度小于0.5%的稀有菌门。

总体而言，土壤含水率及有机质、总磷和总氮含量是影响各土层细菌多样性的主要理化性质。